Nuevas contribuciones de la cromatografía electrocinética con detección UV y de espectrometría de masas en el campo de las separaciones quirales

Abstract

Del conjunto de resultados presentados en esta memoria, es posible extraer las siguientes conclusiones finales: - Se han desarrollado metodologías analíticas utilizando EKC con detección UV que han permitido separar los enantiómeros de un grupo de fármacos antifúngicos de gran interés en la actualidad. En este sentido, se han separado por primera vez los enantiómeros del terconazol y se ha desarrollado la primera metodología analítica por EKC para la separación de los cuatro enantiómeros del itraconazol mejorándose de forma considerable tanto la resolución como el tiempo de análisis con respecto a los proporcionados por otras técnicas de separación. Además, se han obtenido nuevas metodologías analíticas para la separación de los enantiómeros de ketoconazol, bifonazol, miconazol, econazol y sulconazol que han demostrado ser ventajosas con respecto a las anteriormente desarrolladas por CE o HPLC. Las metodologías quirales desarrolladas para ketoconazol e itraconazol se han aplicado con éxito al análisis de diferentes formulaciones farmacéuticas, poniéndose de manifiesto el potencial de las técnicas de EKC en el campo farmacéutico. - El estudio de las interacciones entre un grupo de fármacos antifúngicos y tres de las ciclodextrinas más utilizadas en EKC, no sólo hizo posible el cálculo de las constantes de asociación enantiómero-ciclodextrina, sino que además permitió predecir adecuadamente las concentraciones óptimas de selector necesarias para obtener la mejor separación quiral de dichos compuestos. - Se han presentado nuevas evidencias sobre la posibilidad de invertir de forma sencilla el orden de migración de los enantiómeros en EKC. Así, por primera vez se ha podido demostrar dicha inversión para un compuesto azólico (ketoconazol) al modificar la concentración de la HP-β-CD en el medio de separación, fenómeno que también parece tener lugar para terconazol. - Se han obtenido nuevos datos acerca de la influencia del tamaño de la cavidad y la naturaleza de los sustituyentes de las ciclodextrinas sobre la separación y el orden de migración de los enantiómeros de compuestos quirales. Así, en el caso del deprenil, únicamente β-CD y sus derivados permiten la discriminación de dicho compuesto siendo el enantiómero R el primero en migrar con la β-CD nativa y sus derivados metilados mientras que la acetilación de la β-CD provoca que sea el enantiómero S el que migra en primer lugar. Estos resultados han permitido proponer una nueva metodología analítica para llevar a cabo el control de la pureza óptica del R-deprenil (selegilina) en formulaciones farmacéuticas dada la mayor sensibilidad proporcionada por el método de EKC con respecto al método de HPLC descrito en la Farmacopea, poniéndose de manifiesto el potencial de EKC para la determinación de impurezas enantioméricas. - El desarrollo de metodologías analíticas de EKC-UV-ESI-MS ha permitido por primera vez la detección e identificación del trans-ketoconazol como impureza de síntesis del cis-ketoconazol, tanto en patrones comerciales como en formulaciones farmacéuticas. Asimismo, la comparación de las características analíticas de los métodos de EKC-UV y EKC-ESI-MS ha puesto de manifiesto la validez del primero para la cuantificación de transketoconazol en muestras reales, siendo el segundo imprescindible para su identificación. - Se ha llevado a cabo por primera vez la separación enantiomérica de un ácido tricarboxílico de cadena corta, el ácido 3-carboxiadípico. Para ello, fue necesario desarrollar un método de EKC con vancomicina como selector quiral, utilizando la técnica del llenado parcial del capilar. Dada la baja absorción que presenta este compuesto en la zona UV del espectro, el desarrollo de una metodología EKC-UV ha implicado la utilización de estrategias para el aumento de la sensibilidad, tanto en la inyección (técnicas de preconcentración en el propio capilar basadas en fenómenos electroforéticos, FASS) como en la detección (λ = 190 nm y capilar de burbuja). Ello permitió una mejora en la sensibilidad de detección de unas 960 veces, alcanzándose un límite de detección del orden de 10-7 M para el ácido 3-carboxiadípico. La excelente sensibilidad alcanzada hizo posible la determinación de los excesos enantioméricos del ácido 3-carboxiadípico tras adsorción del mismo sobre minerales, demostrándose que tenía lugar una adsorción enantioselectiva del ácido. Estos resultados constituyen la primera aportación de las técnicas de CE en el campo de la Astrobiología, por lo que suponen una ampliación del campo de aplicación de la CE quiral y presentan un gran interés ya que avalan la teoría abiótica de la homoquiralidad biológica. - El desarrollo de una metodología de EKC-ESI-MS que incluye el empleo de la técnica del llenado parcial del capilar ha hecho posible la separación de los enantiómeros de la carnitina (aminoácido no proteico de gran interés en el campo alimentario) con una resolución suficiente para determinar el contenido del enantiómero D, impureza tóxica de la L-carnitina. La optimización de experimentos MS2 en la aplicación del método EKC-ESIMS desarrollado dio lugar a una mejora en la sensibilidad del orden de 70 veces, lo que permitió alcanzar límites de detección del orden de 25 ng/g (25 ppb) para los enantiómeros de la carnitina. Esta mejora en la sensibilidad de detección fue fundamental para la obtención de espectros inequívocos de los enantiómeros de la carnitina. La aplicación del método a la determinación de carnitina en muestras de leche en polvo infantiles, permitió cuantificar la L-carnitina, dando lugar a valores dispares con los contenidos etiquetados, así como confirmar la presencia de D-carnitina, impureza tóxica de la forma L, en 10 de las 14 muestras analizadas con porcentajes superiores al 0.5 %. - Los resultados obtenidos a lo largo de esta memoria muestran el enorme potencial de la CE en su modo de EKC con CDs en el campo de las separaciones quirales.