Novel bioelectrochemical approaches for exploring extracellular electron transfer in "Geobacter sulfurreducens"

Resum

Los sistemas electroquímicos microbianos son aquellos en los que los microorganismos actúan, en combinación con electrodos, como catalizadores de reacciones redox. Estos sistemas permiten transformar la energía química en energía eléctrica mediante la acción de ciertos microorganismos (e.g. Geobacter sulfurreducens) que tienen la capacidad de oxidar compuestos orgánicos, acoplando dicha reacción a la reducción de un aceptor de electrones extracelular (e.g. electrodos). La fusión de dos campos tan diferentes como la microbiología y la electroquímica ha dado lugar a una disciplina nueva y versátil que requiere la sinergia de ambos. Esta tesis doctoral se compone de 5 capítulos, 3 de ellos experimentales, que exploran diferentes aspectos de los sistemas electroquímicos microbianos, utilizando como modelo de bacteria electroactiva a G. sulfurreducens. El objetivo principal de la investigación fue desarrollar nuevas estrategias para profundizar en la comprensión del proceso de transferencia de electrones extracelular (TEE), así como para explorar nuevas plataformas ioelectroquímicas. En vista de lo anterior, el Capítulo 1 explora el estado del arte sobre el uso de G. sulfurreducens en sistemas electroquímicos microbianos. Dicha bacteria posee la capacidad de establecer contacto electroquímico con aceptores extracelulares mediante a la presencia de una extensa red de citocromos de tipo c que conecta el citoplasma con el exterior celular. Con el fin de confirmar el papel de los citocromos de tipo c en la TEE se han realizado estudios de deleción génica para intentar obtener células incapaces de producir determinados citocromos tipo c. Sin embargo, las construcciones genética resultantes no mostraron el comportamiento (fenotipo) esperado por lo que, en esta tesis, nos planteamos un enfoque alternativo basado en el metabolismo asimilatorio del hierro y su efecto en la síntesis de grupos hemo. Desde un punto de vista microbiológico los sistemas clásicos que se emplean en el desarrollo de la electroquímica microbiana implican complejos montajes experimentales, largos períodos de acondicionamiento y costes sustanciales. En este sentido, la miniaturización de los dispositivos bioelectroquímicos puede suponer ventajas considerables, tales como respuestas en producción de corriente o la reducción de costes. Estas características serían especialmente deseables en sistemas electroanalíticos. Otro requisito para los sistemas electroquímicos microbianos es la formación de un biofilm bacteriano maduro, lo cual suele implicar largos períodos de tiempo. Este proceso podría simplificarse mediante la construcción artificial de un sistema bacteria-electrodo. De acuerdo con los retos identificados, el Capítulo 1 concluye describiendo los tres objetivos específicos que conforman esta tesis doctoral: i) Investigar el papel de los citocromos de Geobacter en la TEE, ii) Explorar los electrodos serigrafiados como instrumentos miniaturizados para una rápida evaluación electroquímica de microorganismos electroactivos, iii) Construir bioelectrodos artificiales basados en Geobacter Con el objetivo de confirmar el papel de los citocromos de tipo c en la TEE, el Capítulo 2 describe un método para el cultivo de células de G. sulfurreducens carentes de citocromos. Los análisis bioquímicos basados en la tinción específica del grupo hemo, junto a otros basados en espectrometría de masas y en espectroscopía Raman, demostraron que es factible modificar el contenido de citocromos en G. sulfurreducens limitando la disponibilidad de hierro en el medio de cultivo. Las células carentes de citocromos eran viables ya que pudieron reducir fumarato a succinato, una reacción a nivel de la membrana interna que no requiere citocromos, pero no fueron capaces de reducir hierro citrato (III) o de intercambiar electrones con un electrodo. Estos resultados confirmaron que los citocromos de tipo c son esenciales para la TEE en G. sulfurreducens. Teniendo en cuenta la necesidad de simplificar los aspectos electroquímicos, el Capítulo 3 investiga el uso de electrodos serigrafiados (SPEs) como una nueva plataforma de bajo coste para evaluar la actividad electroquímica microbiana a un nivel de microescala. Los SPEs resultaron ser válidos para identificar respuestas bioelectroquímicas, evitando complejos montajes. El sistema se validó mediante el estudio de la respuesta de G. sulfurreducens bajo diversos estados fisiológicos. Además, el uso de SPE y G. sulfurreducens reveló su potencial como biosensor para la cuantificación de acetato y para explorar muestras de naturaleza tan compleja como las aguas residuales urbanas. La identificación de consorcios electroactivos resultó ser otra de las aplicaciones de esta tecnología. Como aporte científico final, el Capítulo 4 explora una nueva estrategia para utilizar G. sulfurreducens en la de construcción bioelectrodos artificiales, mediante la inmovilización de las células en gel de sílice sobre electrodos de fieltro de carbono. El análisis de viabilidad confirmó que la mayoría de las células sobrevivieron al proceso de encapsulación y que la densidad celular no evolucionó, al menos, durante un período de 96 h. Esta doble encapsulación impide la liberación de bacterias del electrodo, pero permite la difusión de solutos, haciendo posible la caracterización electroquímica del sistema. Los bioelectrodos artificiales se evaluaron en sistemas de 3 electrodos durante varios días utilizando diversos donadores de electrones. El análisis voltamétrico de los bioelectrodos alimentados con acetato mostró una onda de oxidación catalítica sigmoidal desde el inicio, característica de biofilms más maduros. Además, se confirmó la presencia de G. sulfurreducens dentro de las fibras y del gel de sílice por microscopía electrónica de barrido y también se realizó un análisis transcriptómico para estudiar el efecto de la encapsulación a nivel intracelular. A partir de los resultados obtenidos, el Capítulo 5 presenta una discusión general, conclusiones y perspectivas de futuro. Este capítulo fue concebido con una estructura de preguntas y respuestas que confío ayude al lector a entender las razones que sustentaron tanto nuestra experimentación como la interpretación que hicimos de la misma. El valor fundamental de este trabajo es la naturaleza sencilla, rápida y económica de las herramientas proporcionadas que pueden ayudar a otros investigadores en el campo de la electroquímica microbiana.