Response of the bacterial communities in oxygen limited environments to the presence of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHS)

Laburpena

El uso masivo del petróleo como fuente de energía y como materia prima ha generado serios problemas de contaminación ambiental. Entre los principales contaminantes ambientales, los compuestos aromáticos generan gran preocupación porque son relativamente persistentes en el medio ambiente debido a la alta estabilidad termodinámica del anillo de benceno. El benceno y muchos hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) presentan efectos tóxicos, carcinogénicos, mutagénicos y teratogénicos y su eliminación del medio ambiente es importante para proteger el entorno y la salud humana. Una medida que ha tenido un éxito significativo es el empleo de microorganismos para la eliminación de contaminantes con la aplicación de técnicas de biorremediación. Los procesos aerobios de degradación de HAPs se han caracterizado exhaustivamente durante los últimos años; sin embargo, en muchos ambientes naturales la concentración de oxígeno es limitante y, en estas condiciones, los procesos activos son esencialmente anaerobios. La degradación anaeróbica bacteriana de los compuestos monoaromáticos se ha caracterizado en profundidad; no obstante, la degradación de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) como el naftaleno sólo ha comenzado a ser comprendida en las bacterias reductoras de sulfato, y se sabe muy poco sobre la degradación anaeróbica de los HAPs en bacterias nitrato reductoras. Partiendo de una serie de ambientes que habían sufrido diferentes grados de contaminación por hidrocarburos, utilizamos la técnica del número más probable (NMP) para detectar y cuantificar la presencia de comunidades bacterianas capaces de degradar varios HAPs usando el nitrato como aceptor de electrones. Con el NMP se detectó la presencia de una comunidad nitrato reductora capaz de degradar naftaleno, 2- metilnaftaleno (2MN), y antraceno en algunos de los sitios muestreados. Además, con el fin de aislar cepas capaces de degradar los HAPs en condiciones desnitrificantes, establecimos una serie de cultivos de enriquecimiento con nitrato como aceptor terminal de electrones y HAP como única fuente de carbono y seguimos los cambios en las comunidades bacterianas a lo largo del proceso. Los resultados evidenciaron cambios atribuibles al régimen de respiración de nitrato impuesto, que en varias muestras se exacerbó en presencia de los HAPs. La presencia de naftaleno o 2MN enriqueció a la comunidad en grupos de organismos no cultivados y mal caracterizados, y notablemente en el grupo no cultivado de Acidobacteria iii1-8, que en algunos casos era sólo un componente menor de las muestras iniciales. Otros taxa seleccionados por HAPs en estas condiciones incluyeron Bacilli, que fueron enriquecidos en los cultivos con naftaleno. Varias cepas nitrato reductoras han sido aisladas en medio solido con naftaleno y 2MN como única fuente de carbono, aunque el fenotipo no pudo reproducirse en cultivos líquidos. El análisis de los genes funcionales de degradación anaeróbica de HAPs en las muestras originales y los cultivos de enriquecimiento no revelaron la presencia de secuencias del gen nmsA para la degradación anaerobia de 2MN, pero confirmaron la presencia de genes de bssA relacionados con la degradación anaeróbica de tolueno. En conjunto, estos resultados sugieren que la degradación de las HAPs por las bacterias reductoras de nitrato puede requerir la contribución de diferentes cepas, en condiciones de cultivo que todavía necesitan ser definidas. Los resultados de los NMP de una de las muestras analizadas, los sedimentos anóxicos de Fuente de Piedra mostraron una comunidad importante de nitrato reductores degradadores de naftaleno y, en menor parte, de 2MN. Quisimos entonces tomar muestras para ver la respuesta de la microbiota autóctona de los sedimentos de la laguna ante la presencia de naftaleno, y además iniciar cultivos de sulfato reductores, al ser los sedimentos ricos en sulfatos, para enriquecer degradadores potenciales de HAPs. Las comunidades bacterianas y sus cambios se analizaron mediante secuenciación masiva Illumina MiSeq. Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Gemmatimonadetes y Firmicutes fueron los grupos más abundantes de todos los microcosmos y también los más frecuentemente encontrados en ambientes hipersalinos. Después de 4 y 12 meses de incubación con naftaleno, las comunidades bacterianas de los microcosmos no sufrieron cambios relevantes. El factor estructurante de las comunidades no fue la presencia del contaminante sino el tiempo de incubación de los cores. Sin embargo, se observaron cambios significativos en los enriquecimientos. En particular en el medio mínimo salino diseñado para sulfato reductores hubo un aumento significativo de la familia de las Desulfobulbaceae (Deltaproteobacteria), previamente identificadas como degradadoras anaerobias de tolueno y naftaleno. En los cultivos preparados con el agua filtrada de Fuente de Piedra los Firmicutes fueron el taxa más enriquecido con el dominio del genero Dethiosulfatibacter, un grupo de bacteria probablemente relacionado con la degradación de HAPs. El uso de condiciones diferentes de cultivo ha permitido seleccionar poblaciones diversas, y en particular, el empleo de un medio natural se ha revelado una opción valida para enriquecer microorganismos procedentes de un ambiente extremo como es el de Fuente de Piedra. En cualquier caso, serían convenientes ensayos adicionales para determinar la actividad degradadora de las poblaciones seleccionadas, y detectar los posibles genes implicados en la ruta. Además de condiciones estrictamente anaerobias para nitrato y sulfato reductores, quisimos testar condiciones de microaerofilia para aislar cepas degradadoras de HAPs. Estas condiciones son la que más se acercan, en muchos casos, a las condiciones ambientales reales, donde hay gradientes de concentración de oxígeno. Establecimos cultivos de enriquecimiento a partir de una muestra de acuífero contaminado con petróleo, utilizando condiciones anóxicas o microaerofílicas y HAPs como única fuente de carbono. A pesar de la presencia de una comunidad significativa de bacterias nitrato reductoras detectada con el NMP, la comunidad inicial, dominada por Betaproteobacteria, era incapaz de degradar la HAPs en condiciones anóxicas estrictas, aunque se observó un claro cambio en la estructura de la comunidad hacia un aumento en la Alphaproteobacteria (Sphingomonadaceae), Actinobacteria y un grupo no cultivable de Acidobacteria en los enriquecimientos. Por otro lado, el crecimiento en condiciones microaerofılicas con naftaleno como fuente de carbono evidenció el desarrollo de una estructura de biofilm alrededor del cristal de naftaleno. Después de varios pases, el 97% de la comunidad bacteriana y del biofilm estaba compuesto por solo dos géneros: Variovorax spp. (54%, Betaproteobacteria) y Starkeya sp. (43%, Xanthobacteraceae). Las dos cepas eran capaces de crecer con naftaleno, aunque sólo Starkeya tenía la habilidad de reproducir la estructura del biofilm alrededor del cristal de naftaleno. También se identificó la ruta para la degradación del naftaleno, que incluía dioxigenasas con alta afinidad por el oxígeno y que mostraba una identidad del 99% con el grupo de dbd de Xanthobacter polyaromaticivorans para la degradación de HAPs. Dada la presencia en nuestros primeros pases de los enriquecimientos de Xanthobacter polyaromaticivorans probablemente la ruta de degradación del naftaleno haya sido adquirida por Starkeya por transferencia horizontal. Por otro lado, la capacidad de formar biofilm de Starkeya ha favorecido la cepa en el cultivo, proporcionando una estructura compleja para situarse a una distancia apropiada de la fuente de carbono tóxico y crear un ambiente favorable al crecimiento.En conjunto, hemos estudiado las respuestas de las comunidades bacterianas a los HAPs en las condiciones limitantes de oxígeno más frecuentemente encontradas en la naturaleza (nitrato reductoras, sulfatoreductoras y microaerofilicas) pero menos investigadas tanto por las dificultades de cultivos de estas bacterias como por los largos tiempos de crecimiento que requieren estos microorganismos. No hemos logrado aislar cepas anaerobias estrictas capaces de degradar HAPs, pero sí de individualizar poblaciones bacterianas presentes en la naturaleza y probablemente involucradas en la eliminación de contaminantes en el medio ambiente. También hay bacterias no cultivables (v.g. Acidobacteria, iii1-8) que se han enriquecido, de las cuales todavía desconocemos el papel ecológico, pero que podrían ser importantes en la biodegradación anaerobia. En condiciones de microaerofilia, sí hemos logrado cepas degradadoras, y además capaces de formar biofilm a partir de HAPs. El crecimiento en forma de biofilm es probablemente una manera de crecer que las bacterias adoptan en condiciones de estrés y que le ayuda a hacer frente a los factores adversos. Esto posiblemente nos indique que las condiciones de cultivo que imponemos en el laboratorio son demasiado restrictivas y se alejan de la variabilidad que hay en la naturaleza.