Caracterización de un nuevo mutante termosensible de la RNasa E en el metabolismo del RNA de "Escherichia coli"

Resumen

La endorribonucleasa E (RNasa E) de Escherichia coli, fue inicialmente descubierta como una enzima implicada en la maduración del RNA ribosómico (rRNA) 5S. Posteriormente, se demostró el papel multifuncional de la RNasa E en diferentes aspectos del metabolismo del RNA de E. coli, incluyendo la degradación de la mayoría de los RNA mensajeros (mRNAs), procesamiento de los extremos 3’ de los RNA transferentes (tRNAs), maduración del rRNA 16S, procesamiento y/o degradación de RNA reguladores pequeños (sRNAs), procesamiento de la subunidad de RNA (M1 RNA) de la RNasa P y control de la replicación de los plásmidos tipo ColE1 mediante la degradación de un RNA antisentido represor de la replicación denominado RNAI. Además de su importante papel en el metabolismo del RNA, se ha sugerido que la RNasa E forma parte del citoesqueleto de E. coli. La inactivación de esta enzima resulta en la producción de una morfología celular filamentosa e incapacidad para formar colonias en medio sólido. La acción de la RNasa E es esencial para la viabilidad de E. coli, y está conservada en la mayoría de las bacterias Gram negativas y en un número limitado de Gram positivas, lo cual la convierte en una potencial diana terapéutica. La RNasa E presenta un dominio N-terminal donde reside la actividad catalítica, una región central rica en argininas implicada en la unión al RNA (ARRBS) y una región C-terminal que sirve como plataforma de anclaje para otras proteínas implicadas en la degradación de mRNA, formando un complejo multiproteico denominado degradosoma. Sin embargo, solamente la región N-terminal de la RNasa E es necesaria para mantener la viabilidad celular, y es la región de la proteína más conservada durante la evolución. El análisis de los dos únicos mutantes termosensibles de la RNasa E de E. coli (rne-1 y rne-3071), caracterizados hasta hoy, han contribuido enormemente al conocimiento de la función de la RNasa E en E. coli. A pesar de los importantes progresos realizados en la determinación de la importancia funcional de la RNasa E en el metabolismo del RNA y la resolución de la estructura cristalina del dominio N-terminal catalítico, existe un limitado conocimiento de los residuos de aminoácidos y subdominios funcionales de la RNasa E implicados en la unión al sustrato, la especificidad de corte y su dependencia por el extremo 5’ monofosforilado del sustrato. La presente memoria de tesis describe el aislamiento y la caracterización in vivo de un nuevo mutante termosensible de la RNasa E, que presenta la sustitución de un aminoácido (Pro?Leu) en la posición 204 de la secuencia de aminoácidos de la RNasa E. El análisis de este mutante fue realizado tanto en su forma completa, rne-204, como en una forma truncada, rne?645/204, la cual contiene los primeros 417 aminoácidos del dominio catalítico N-terminal, pero carece de la región ARRBS y de la región de andamiaje del degradosoma. Esta mutación está localizada en el domino N-terminal y dentro del subdominio denominado 5’sensor, el cual está implicado en el reconocimiento de los extremos 5’ de los sustratos de RNA de la RNasa E. Analizamos el efecto in vivo de dicha mutación sobre la tasa de crecimiento, la viabilidad celular, el procesamiento del 5S rRNA, la maduración de distintos tRNAs, así como las vidas medias de diversos mRNAs y la regulación de la propia RNasa E. Por otro lado, se examinó en estos mutantes el efecto en los niveles de expresión de los genes, ftsZ y ftsA, esenciales para la correcta división celular y cuyos transcritos primarios son procesados por la RNasa E, así como la morfología celular de estos mutantes en condiciones de temperatura permisiva y no permisiva. Los resultados obtenidos del estudio de estos mutantes demuestran que el subdominio 5’ sensor es importante para la actividad catalítica de la RNasa E y que la región C-terminal de andamiaje del degradosoma no es esencial, pero si necesaria para una eficiente degradación y procesamiento del RNA. Además, estos mutantes presentan un crecimiento dependiente de la temperatura acompañado de un defecto general del metabolismo del RNA y una pérdida de la autorregulación de la RNasa E. Sorprendentemente, el análisis microscópico de los mutantes reveló una relación entre el bloqueo de la citocinesis y la inactividad de la RNasa E.