Desarrollo de técnicas basadas en la PCR en tiempo real para el diagnóstico de las infecciones fúngicas invasoras

Abstract

Esta tesis describe el desarrollo, estandarización y validación de técnicas de PCR en tiempo real para el diagnóstico precoz y específico de las distintas especies más frecuentes causantes de infección fúngica invasora. El desarrollo de este trabajo se estructuró en cuatro fases. En la primera fase se llevó a cabo el diseño de cada una de las PCRs cuantitativas en tiempo real, con el consiguiente diseño de iniciadores y sondas especie-específicas de tipo molecular beacon para la amplificación ú nica y, por tanto, detección específica de la especie a estudiar. Las especies estudiadas fueron las siguientes: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus terr eus, Scedosporium apiospermum, Scedosporium prolificans y Fusarium solani. Una vez finalizado dicho diseño, se realizó la estandarización ¿in vitro¿ de cada una de las técnicas de PCR. En esta estandarización se estudió la reproducibilidad, sensibili dad y especificidad de cada PCR en tiempo real, utilizando ADN genómico de las distintas especies. Los resultados demostraron que cada una de las técnicas era reproducible y se obtuvieron buenos datos en cuanto a sensibilidad y especificidad. En una segunda fase experimental, se procedió a estandarizar los distintos modelos animales murinos de infección para cada una de las especies fúngicas en estudio. Se desarrollaron dichos modelos con ratones adultos inmunocompetentes a los que se inmunodepr imió siguiendo un protocolo establecido. Para cada uno de los modelos se utilizaron las cepas empleadas en la fase anterior de estandarización ¿in vitro¿. En esta fase se obtuvieron muestras de sangre, suero y tejido (pulmón/riñón). Se realizaron lo s ensayos de PCR en tiempo real a cada una de las muestras recogidas. Asimismo, se realizó el cultivo de las muestras tisulares de cada animal para confirmar la infección fúngica probada. Los resultados de la validación en los modelos animales demo straron que las técnicas eran eficaces, obteniéndose datos de sensibilidad en muestras tisulares cercanos al 100 . En muestras hematológicas, suero y sangre, la sensibilidad fue menor y dependió del tipo de especie fúngica causante de la infección. E n una tercera fase se validó la técnica de PCR en tiempo real para Aspergillus fumigatus en muestras clínicas (suero y sangre) de pacientes oncohematológicos del Hospital Universitario Doce de Octubre (Madrid). Los resultados obtenidos demostraron...