Influencia del aporte de células troncales mesenquimales derivadas del tejido adiposo en la reparación del manguito rotador: modelo experimental en rata

Resumen

Resumen INTRODUCCIÓN Las roturas del manguito rotador constituyen una lesión muy prevalente en la sociedad actual con un incremento en su incidencias en los últimos 10 años y que supone un gran coste económico. Se ha demostrado así mismo que la incidencia de re-roturas es muy alta y de forma subsecuente, la cirugía de revisión. Una de las grandes controversias en la cirugía del manguito rotador actualmente es si el fracaso de la sutura condiciona el resultado clínico. Aunque algunos autores defienden que la función y satisfacción del paciente no depende de la integridad de la reparación, más recientemente los autores defienden que la ausencia de cicatrización constituye un factor pronóstico. Se ha demostrado que el fracaso de la sutura tendinosa en muchas de las ocasiones no es una re-rotura, sino un fracaso en la cicatrización en la región de inserción hueso-tendón. La mayoría de éstas ocurren entre las 6 y 26 semanas de la cirugía y la mayor parte de los pacientes no relatan un evento traumático. Ante esta situación, en un primer momento se optó por realizar modificaciones técnicas en cuanto al tipo de sutura, el tipo de nudo o los materiales. Estas innovaciones han obtenido resultados controvertidos. En un segundo lugar, los esfuerzos se han centrado en intentar mejorar la biología de la reparación para favorecer la regeneración de la entesis. Las células troncales mesenquimales han sido ampliamente utilizadas en numerosos modelos en el sistema músculo-esquelético, incluyendo defectos óseos y cartilaginosos, lesiones meniscales o lesiones de ligamento cruzado anterior. En el modelo del manguito rotador, las MSC han sido utilizadas por grupos de investigación con resultados variables. Las CMDL han demostrado capacidad hipoinmunogénica y capacidad de diferenciación en numerosas estirpes celulares. Además han demostrado ser capaces de estimular la cicatrización en modelos de fístulas rectovaginales y perianales, de tendón de Aquiles o en modelos vasculares. El objetivo de este estudio es evaluar la influencia de la aplicación de CMDL en un modelo animal de rotura de manguito rotador, mediante la cuantificación de las propiedades biomecánicas e histológicas de la región de reparación. MATERIAL Y MÉTODO Se emplearon 50 ratas Sprague-Dawley con un peso que oscilaba entre 280 y 330 gr y una edad de 8 semanas. De ellas, 32 se destinaron al estudio biomecánico y 18 al estudio histológico. Los animales fueron randomizados en dos grupos de cirugía para el estudio biomecánico y en tres para el estudio histológico. La cirugía consistió en una desinserción del tendón supraespinoso de la rata ( unilateral para el estudio biomecánico y bilateral para el histológico) que fue suturado en el mismo acto quirúrgico de forma transósea mediante una sutura monofilamento no absorbible. Como coadyuvante a esta sutura, en uno de los grupos se realizó aporte de 2x106CMDL utilizando un soporte de esponja de colágeno y en otro de los grupos aporte del vehículo de colágeno de forma aislada. Para el grupo de histología se incluyó un grupo en el que se realizó únicamente sutura del tendón con fines comparativos. Las CMDL fueron obtenidas del tejido graso abdominal de dos ratas, mediante el proceso establecido por el laboratorio de terapia celular. Para su aislamiento se realiza una disgregación mecánica y enzimática. Una vez aisladas se realiza un cultivo in vitro y una expansión de las mismas. Después son caracterizadas mediante inmunoflourescencia y citometría de flujo y criopreservadas hasta su utilización. Finalmente, en las CMDL de dos de los animales se realizó marcaje con en inmunotrazador citoplasmático Dil para demostrar su presencia en las muestras tratadas. El sacrificio se realizó a las 2 y 4 semanas de la cirugía para el grupo del estudio biomecánico y a las 24 horas, 1 semana y 4 semanas para el histológico. El estudio biomecánico consistió en un ensayo a tracción realizado mediante una presa electromecánica. Se utilizó una precarga de 0,1 N y la velocidad fue de 14 micras/seg. Las variables medidas fueron carga de rotura(N), carga elástica( N), deformación mecánica (mm), rigidez (N/mm2) y energía absorbida (J). Para el estudio histológico, se realizaron técnicas morfométricas( Hematoxilina-Eosina, Tricrómico de Masson , Verhoff-Van Gieson y Orceína y Rojo Sirio) y técnicas inmunohistoquímicas y de inmunofluorescencia. Los datos recogidos fueron analizados mediante el programa estadístico Statistical Package for Social Sciences versión 11.5 (SPSS, Chicago, IL). Se realizó un estudio descriptivo de las variables cuantitativas continuas y discontinuas. Las comparaciones entre las variables cuantitativas continuas se realizaron mediante test no paramétricos (U de Mann- Whitney). Para las variables cuantitativas discontinuas se utilizaron el test de Pearson (Chi cuadrado) y el test exacto de Fisher. El nivel de significación se estableció para valores de p<0.05. OBJETIVO DEL TRABAJO La finalidad de este trabajo es evaluar las propiedades biomecánicas y características histológicas de la región de reparación de la entesis del tendón supraespinoso en un modelo experimental de rotura de manguito rotador tras aportar células troncales mesenquimales derivadas del tejido adiposo. RESULTADOS Respecto al estudio biomecánico no se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos para ninguna de las variables estudiadas para ninguno de los tiempos de sacrificio. A las dos semanas, la carga de rotura fue de 14,05 N (DE 4,11) para el grupo control y 15,63 N (DE 4,77) para el grupo con aporte de CMDL (p=0,23). A las cuatro semanas, la carga de rotura fue de 18,7 N (DE 3,5) para el grupo control y 18,75 N para el grupo con aporte de CMDL (p=1). Al comparar la carga de rotura para el grupo control entre los animales sacrificados a las 2 semanas y a las 4 semanas, los resultados demostraron una diferencia estadísticamente significativa (p= 0,04). No ocurrió así al comparar los valores a las 2 y 4 semanas en el grupo con CMDL(p=0,17). La deformación mecánica a las dos semanas fue 3,07 mm (DE 1,03) en el grupo control y 3,79 mm (DE 1,55) en el grupo CMDL(p=0,09) y la energía absorbida fue 3,39 J (DE 2,33) para el grupo y 7,42 J (DE 4,23), siendo sus diferencias no significativas (p=0,06). A las 4 semanas, la deformación mecánica fue 3,89 mm en el grupo control y 6,37 mm en el grupo CMDL(p=0,1) y la energía absorbida fue 5,34J para el grupo control y 12,66J para le grupo con CMDL(p=0,18). Respecto al estudio histológico, a las 24 horas y una semana se apreciaba un patrón de inflamación menos agudo, con menor presencia de vasos, edema y neutrófilos. No se apreciaron diferencias en la cantidad, tipo de colágeno y orientación de las fibras de colágeno para ninguno de los tiempos de sacrificio. En el grupo con aporte de CMDL la aparición de colágeno estaba retrasada, de tal forma que sólo podía apreciarse en las muestras correspondientes a las 4 semanas de sacrificio. DISCUSIÓN Las reparaciones del manguito rotador fracasan de forma frecuente debido a que la estructura compleja de la entesis nativa no se regenera en el proceso de cicatrización. En un intento de favorecer la biología de la reparación, numerosos tratamientos han sido propuestos, sin haber encontrado aún una solución a este problema. En nuestro estudio, la aplicación de CMDL en un modelo de rotura de tendón supraespinoso en ratas no ha demostrado mejorar las propiedades biomecánicas de la zona de reparación. La energía absorbida a las 2 semanas fue casi el doble para el grupo en el que se aplicaron CMDL así como la deformación mecánica. Aunque estas diferencias no fueron significativas, los valores podrían tener relevancia cuando los relacionamos con los hallazgos histológicos. Hemos encontrado un patrón menos agresivo de inflamación aguda en el grupo con CMDL con menor presencia de edema, vasos y PMN. No encontramos diferencias en la cantidad, tipo u orientación de las fibras de colágeno, sin embargo, la presencia de colágeno tipo I y III fue detectable en el grupo de CMDL únicamente en el grupo sacrificado a las 4 semanas. Parece por tanto, que la aplicación de CMDL podría modificar el patrón inflamatorio, retrasando la cicatrización y condicionando la presencia de un tejido más elástico, capaz de deformarse más antes del fracaso mecánico, y precisando una mayor cantidad de energía para ello. Estos resultados son esperanzadores, pero es necesario un conocimiento más profundo de los mecanismos moleculares que condicionan la cicatrización del manguito rotador para poder actuar específicamente sobre ellos.