Análisis de la expresión génica global en estados iniciales del carcinoma no microcítico de pulmónidentificación de un predictor de recidiva asociado con las células B del sistema inmune

Résumé

ANTECEDENTES El cáncer de pulmón es la primera causa de muerte por cáncer con una tasa anual de más de 1.1 millones de personas en todo el mundo. Aproximadamente el 80% de los casos diagnosticados se clasifican como carcinoma no microcítico de pulmón (CNMP) y el 20% restante corresponden a carcinoma microcítico de pulmón (CMP). La tasa de supervivencia a cinco años entre los pacientes diagnosticados de cáncer de pulmón es sólo del 15%. El sistema de estadiaje TNM basado en el tamaño del tumor (T), la afectación ganglionar (N) y la presencia de metástasis a distancia (M) es, en la actualidad, el factor pronóstico más utilizado en los pacientes con CNMP. En base a los estadios de la clasificación TNM, la resección quirúrgica con linfadenectomia es el tratamiento de elección en estadios iniciales del CNMP (I y II), mientras que en estadios avanzados las combinaciones de quimioterapia y el reciente uso de agentes biológicos de manera individualizada es lo más habitual. Sin embargo el TNM no es capaz de explicar toda la heterogeneidad biológica del tumor como demuestra la tasa de recidiva a 5 años para los estadios IA, IB, IIA y IIB que es del 16%, 23%, 37% y 39% respectivamente. Ya que los métodos actuales no son totalmente precisos para definir el pronóstico de los estadios tempranos del CNMP, es necesario desarrollar herramientas adicionales que puedan ser usadas clínicamente y que nos permitan predecir de manera más exacta cuál será la evolución de los pacientes consiguiendo identificar los pacientes completamente resecados y clasificados como estadio IA que puedan beneficiarse de la quimioterapia adyuvante y los pacientes clasificados como estadios IB y estadios II que tengan bajo riesgo de recurrencia con lo que la quimioterapia no sería necesaria. La técnica de microarrays surge como un método para estudiar la expresión de miles de genes de manera simultánea. El desarrollo de esta nueva metodología se ha visto impulsado de manera significativa gracias a dos hechos clave de la historia de la biología molecular como ha sido conocer la secuencia del genoma humano y la rápida evolución de las técnicas de análisis molecular. La oncología es una de las áreas en las que los microarrays han despertado mayor interés, quizás debido a la posibilidad de esta técnica de dar a conocer la gran variabilidad molecular inherente a esta enfermedad. La metodología de microarrays es una herramienta muy potente para la identificación de firmas génicas con valor pronóstico pero es necesaria la estandarización de su metodología para poder obtener información que pueda ser trasladada a la rutina clínica diaria. Una de las aplicaciones directas en el CNMP sería la obtención de un método robusto que sea capaz de estratificar pacientes en grupos de buen y mal pronóstico y que genere información adicional al método convencional de clasificación pronóstica del CNMP, que en la actualidad es la clasificación TNM. HIPÓTESIS El análisis del perfil de expresión génica global en pacientes con estadios iniciales del CNMP sometidos a resección quirúrgica con linfadenectomía, permite obtener una clasificación molecular capaz de identificar el riesgo de recidiva para estos pacientes. RESULTADOS En el estudio no se encontró asociación estadísticamente significativa entre ninguna de las variables clínico-histopatológicas estudiadas con el Intervalo Libre de Enfermedad (ILE). Solamente la presencia de mutaciones de K-RAS mostró tendencia respecto al ILE con una p=0.072. La clasificación molecular no relacionada con los subtipos histológicos se llevó a cabo utilizando los 84 tumores incluidos en el estudio y el listado de 2.160 genes y permitió diferenciar tres grupos moleculares o clusters (Cluster 1, Cluster 2 y Cluster 3) en lo referente a la distribución de las muestras. La curva de Kaplan-Meier (KM) mostró diferencias estadísticamente significativas respecto al ILE (p=0.004) entre los tres clusters indicando una menor probabilidad de recidiva para el Cluster 3 respecto del Cluster 2 y Cluster 1. Además se encontró que existe asociación estadísticamente significativa de estos tres clusters no relacionados con la histología y el hábito tabáquico (p=0.002), la afectación ganglionar (p=0.041) y la inflamación crónica (p=0.002). El cluster 1 es que el incluye el mayor número de muestras tumorales provenientes de pacientes que fuman de manera activa en el momento del diagnóstico. Además incluye los tres únicos tumores con afectación ganglionar y un elevado número de tumores caracterizados con inflamación crónica baja o leve. El Cluster 2 se caracteriza por incluir los cinco únicos pacientes no fumadores de todo el estudio y también un elevado número de tumores caracterizados con inflamación crónica baja o leve. El Cluster 3 es el que incluye el mayor número de pacientes exfumadores en el momento del diagnóstico y el que incluye el mayor número de tumores caracterizados con una inflamación crónica alta. Para confirmar el valor pronóstico asociado a la clasificación molecular en tres clusters se utilizó como matriz externa o matriz de validación la publicada en el estudio de Roepman et al. (2009). La curva de K-M obtenida en esta matriz mostró que, la nueva clasificación molecular en tres clusters generada a partir de la matriz de desarrollo del HCSC, está asociada de manera estadísticamente significativa con el ILE (p=0.022). Ya que no existen diferencias estadísticamente significativas respecto al ILE entre los dos clusters de mal pronóstico (Cluster 1 y Cluster 2; p = 0.526), se simplificó la clasificación molecular de tres a dos clusters, uno de mal pronóstico o alto riesgo de recidiva (Cluster 1 + Cluster 2) y otro de buen pronóstico o bajo riesgo de recidiva (Cluster 3) para así facilitar la identificación de las claves moleculares implicadas en las recidivas de los pacientes en estadios I y II del CNMP. Utilizando de nuevo la matriz de desarrollo con la clasificación molecular en dos clusters y aplicando la técnica PAM, se generó un predictor de 50 genes que se utilizó para clasificar los pacientes de la matriz de validación en uno de los dos grupos moleculares definidos (alto riesgo de recidiva o mal pronóstico y bajo riesgo de recidiva o buen pronóstico). Las curvas de K-M mostraron que entre los dos cluster existen diferencias estadísticamente significativas respecto al ILE (p=0.001). El análisis por estadio en la matriz de validación corroboró que el predictor de 50 genes era capaz de clasificar los pacientes en subgrupos de buen y mal pronóstico tanto dentro del estadio I como dentro del estadio II. El predictor de 50 genes refleja, por su composición, la gran importancia que tiene la respuesta immune basada en células B en el pronóstico de los pacientes en estadios iniciales de CNMP. En función de su nivel de expresión, todos los genes del predictor se encuentran sobre-expresados en el grupo de bajo riesgo de recidiva respecto del grupo de alto riesgo, con lo que podemos inferir que dicha sobre-expresión nos indica la presencia de una mayor respuesta inmune intratumoral que además se asocia a un mejor pronóstico de estos pacientes. El predictor obtenido genera una información pronostica muy relevante clasificando, con mayor claridad que el TNM, a los pacientes en función del riesgo de recidiva. Mediante el estudio de estos 50 genes somos capaces de identificar los pacientes en estadio I con pronóstico desfavorable que podrían beneficiarse de un tratamiento adicional y pacientes en estadio II con buen pronóstico que no parecen obtener beneficio de la quimioterapia e incluso sufren los efectos secundarios tóxicos de este tratamiento. Además, como el predictor de recidiva obtenido incluye genes relacionados principalmente con las células B del sistema inmune, éstos podrían convertirse en potenciales dianas para la manipulación génica con la finalidad de potenciar la respuesta inmune anti-tumoral que reduce significativamente el riesgo de recidiva en los estadios iniciales del CNMP. Los resultados presentados son capaces de mejorar la selección de pacientes susceptibles de tratamiento adicional a la resección quirúrgica con linfadenectomía a la vez que abre la puerta a nuevas posibilidades para la inmunoterapia y el desarrollo de vacunas.