Caracterización genómica del microalga Trebouxia sp. TR9 aislada del liquen Ramalina farinacea (L.) Ach. mediante secuenciación masiva

Resumen

Los líquenes son complejas entidades simbióticas originadas por asociaciones cíclicas e interacciones positivas de organismos muy diferentes, un hongo heterotrófico y uno o varios “fotobiontes” autótrofos fotosintéticos, tanto algas verdes unicelulares, como cianobaterias o ambos. Además, comunidades específicas de bacterias aparecen como simbiontes obligados de líquenes. En todos los talos del liquen Ramalina farinacea (L.) Ach., coexisten las dos mismas especies de algas Trebouxia (T. jamesii -TR1- y Trebouxia sp. TR9). Esta forma de asociación simbiótica específica y selectiva es interesante como modelo de la coexistencia de dos especies diferentes de Trebouxia dentro de un mismo talo liquénico. Esta coexistencia es probable que sea promovida por diferentes contextos fisiológicos. Trebouxia sp. TR9 muestra respuestas originales que se inducen frente al estrés abiótico y tiene un mejor rendimiento fisiológico que T. jamesii. Estas características pueden ser el reflejo de su mayor capacidad para llevar a cabo ajustes metabólicos clave. Para investigar la base genética de la plasticidad de esta especie de microalga, se ha generado un estudio de las secuencias genómicas de Trebouxia sp. TR9 utilizando NGS. El ADN total obtenido de cultivos de Trebouxia sp. TR9 aislados del liquen Ramalina farinacea fue secuenciado con las tecnologías 454 y Solexa con objeto de analizar su estructura genómica e investigar nuevas secuencias de genes mediante la comparación con las bases de datos existentes de genomas de algas verdes. Como resultado, se han obtenido las secuencias de los genomas cloroplástico, mitocondrial y nuclear de Trebouxia sp. TR9. Los genomas mitocondriales y cloroplásticos han sido anotados de forma manual y se han identificado en ellos un total de 61 y 108 genes, respectivamente. El genoma mitocondrial es de naturaleza circular y tiene un tamaño de 70.070 nt. en algunos de los genes anotados se han localizado 9 intrones de tipo I, algunos de los cuales contienen ORFs que codifican “Homing endonucleases” de la familia LAGLIDADG. El genoma cloroplástico de Trebouxia sp. TR9 es también de naturaleza circular y posee la estructura cuatripartita típica de los cloroplastos de plantas vasculares, las regiones repetidas invertidas o IR incluyen un único gen, el rbcL. El tamaño final del genoma cloroplástico obtenido ha sido de 303.323 nt siendo uno de los mayores tamaños conocidos en el contexto de las algas verdes de la división Chlorophyta. En algunos genes, se han identificado 12 intrones de tipo I, 6 de ellos con ORFs que podrían codificar “Homing endonucleasas” de la familia LAGLIDADG. El genoma nuclear de Trebouxia sp. TR9 ha sido ensamblado con el programa Velvet utilizando diferentes tamaños de K-mer (21-133). El ensamblaje más óptimo del genoma nuclear abarcaba 2.626 "contigs" que tenían una longitud total de 59.121.427 nt junto a un tamaño de “contig” N50 y N95 de 142.866 nt y 21.727 nt, respectivamente. Para comprobar la continuidad del ensamblaje nuclear se ha utilizado el espacio génico calculado con la herramienta CEGMA. El genoma nuclear comprendía un 91 y 97 % del conjunto de 248 CEGs de forma completa y parcial, respectivamente. La anotación del genoma nuclear se basó en la predicción de genes “ab initio” con el programa AUGUSTUS entrenado con los modelos obtenidos anteriormente con el programa CEGMA. Como resultado, se obtuvieron 9.499 posibles modelos génicos, 6.364 fueron anotados con al menos un término de Gene Ontology (GO) y de ellos, 2.249 mostraron un número enzimático asociado. Se han encontrado elementos móviles en el genoma nuclear, la mayoría de ellos son retrotransposones con repeticiones terminales largas (LTR), de los cuales, los más abundantes son de tipo Gypsy/DIRS1 y Ty1/Copia. Se han detectado un total de 10.922 dominios proteicos PFAM presentes en 6.544 modelos proteicos de los que 2.147 y 2.979 son compartidos por todas o por, al menos, una de las especies de microalgas verdes con las que se ha comparado este genoma (Asterochloris sp., Chlorella variabilis, Coccomyxa subellipsoidea y Chlamydomonas reindhartii), respectivamente. Además, se han encontrado 19 motivos PFAM específicos de la división Chlorophyta, 6 motivos propios de las algas liquénicas Trebouxia sp. TR9 y Asterochloris sp y 23 motivos propios de Trebouxia sp. TR9. La identificación de proteínas relacionadas con la asimilación de carbono sugiere que Trebouxia sp. TR9 puede tener mecanismos de concentración de carbono de tipo C3 y C4/CAM. El estudio de enzimas relacionadas con el metabolismo de carbohidratos presentes en los modelos proteicos de Trebouxia sp. TR9 y otras algas de la clase Trebouxiophyceae indica que, entre el 11 y el 12 % de las proteínas totales de estas algas, pertenecían al menos a un clan de las familias de la base de datos “Carbohydrate-Active enZYmes Database” (CAZy). Además, las anotaciones de genes revelaron la existencia de proteínas relacionadas con virus. Los datos obtenidos en esta tesis doctoral no sugieren una reducción dramática del genoma de Trebouxia sp. TR9 que pueda relacionarse a su forma de vida simbiótica. Este trabajo ofrece una visión general de los tres genomas del microalga Trebouxia sp. TR9 y de sus principales características y estructuras, que aportan datos inéditos y relevantes para el análisis de las tendencias evolutivas de las Trebouxiophyceae. Así, p. ej., respecto a otras filogenias realizadas en base a genes cloroplásticos, la realizada aquí con las secuencias de las proteínas codificadas por siete genes del genoma mitocondrial de Trebouxia sp. TR9 y los de 25 especies de algas verdes, han puesto de manifiesto dos nuevas diferencias fundamentales: (i) la monofilia de la clase Trebouxiophyceae y (ii) la posición de la clase Pedinophyceae más relacionada con las Chlorophyceae y Ulvophyceae.