Caracterización bioquímica y molecular de la enzima desoxiuridina 5-trifosfato nucleótido hidrolasa de plasmodium falciparum

Zusammenfassung

Plasmodium falciparum es un parásito protozoo apicomplexo causante de la malaria, una enfermedad que afecta a 300-500 millones de personas y a la que unos 2400 millones están expuestas. La gran versatilida, tanto biológica como bioquímica del parásito le permite desarrollar mecanismos de resistencia con una rapidez tal, que supera el tiempo necesario para el desarrollo de nuevos fármacos o una vacuna, por lo que es necesario la caracterización de nuevas enzimas blanco de acción de fármacos. En este trabajo de Tesis Doctoral se estudia la desoxiuridina 5'-trifosfato nucleótido hidrolasa (dUTPasa) como potencial blanco de acción de fármacos. La enzima cataliza la hidrólisis de dUTP a dUMP y pirofosfato, desempeñando una papel biológico esencial en el control de los niveles intracelulares de dUTP e impidiendo una incorporación tóxica de uracilo al DNA. Se ha identificado y clonado el gen que codifica la dUTPasa a partir del clon 3D7 de P.falciparum. El gen que codifica para la enzima presenta una alta similitud con las secuencias de dUTPasa triméricas descritas en otros organismos y posee los cinco motivos consenso característicos de esta familia. Sin embargo presenta una inserción rica en lisina y aspártico entre el primero y el segundo motivo que es exclusiva de especies de Plasmodium. Se ha llevado a cabo la sobreexpresión de la proteína recombinante en E.coli utilizando el sistema de expresión pET. La proteína recombinante se purifició y se llevó a cabo una caracterización cinética exhaustiva, así como la determinación de ciertas características físico-químicas. Se determinó que la unidad funcional de la enzima es un trímero con unos parámetros cinéticos semejantes a los encontrados en otras dUTPasas en cuanto a hidrólisis del dUTP y especificidad de sustrato. En otra parte del trabajo realizado se ha estudiado la localización intracelular de la enzima en las formas intraeritrocíticas del p