Disección genética de los mecanismos reguladores del desarrollo de la semilla de maiz

Resumen

En esta tesis se ha desarrollado una nueva técnica para la búsqueda del gen causal de fenotipos de interés en una colección de plantas de maíz mutagenizadas con el transposón Mu. Dicha técnica se basa en la amplificación de FSTs (secuencias flanqueantes de la inserción) desde RNA previo paso a cDNA mediante RACE 5 o 3. Se ha observado que un paso de SSH (supresive substraction hibridization) de los cDNAs FSTs de dos individuos mutantes independientes con el procedente de otro silvestre mejora notablemente la eficacia del proceso. En los casos en que se disponía de información previa sobre la localización aproximada de los genes causales en el genoma de maíz ha resultado útil añadir un paso de secuenciación masiva mediante 454 de las productos del SSH y seleccionar aquellos productos correspondientes a genes localizados en el intervalo definido. La técnica se ha empleado en una población procedente de la empresa de biotecnología Biogemma S.A. consistente en 25.000 líneas de las que se han seleccionado 300 que mostraban un fenotipo de granos con problema en el llenado y una segregación 3:1. De esas 300 líneas se han analizado 72 en la presente tesis con material procedente, típicamente, de dos granos mutantes y uno silvestre. En 44 se ha aplicado también la técnica de SSH y en 8 de estas últimas la secuenciación masiva mediante 454. Se han identificado inserciones con ligamiento total a la mutación en 3 de las líneas y parcial (posiblemente por la presencia de una segunda inserción causal) en una cuarta línea. Todavía no se ha completado el análisis de los candidatos obtenidos en las 8 líneas sujetas a secuenciación masiva. En esta tesis se ha iniciado también la caracterización de una de las tres líneas mutantes en las que se ha encontrado una inserción con ligamiento total al fenotipo. En ella está afectado el gen ZmETO1 implicado en la regulación pos-transcripcional negativa de la actividad de los enzimas ACC sintasas, que intervienen en la síntesis de etileno. La inserción de Mu parece producir una reducción en la actividad de ZmETO1, lo que debería causar una mayor producción de etileno. No obstante, no se han encontrado fenotipos similares en plantas transgénicas de maíz portadoras de construcciones RNAi para ZmETO1 ni tampoco en otras con construcciones que causen sobre-expresión de ZmETO1 en toda la planta o en el endospermo de la semilla maíz en desarrollo, aunque la sobreespresión en grano afecta visiblemente al desarrollo de diferentes dominios tisulares del endospermo. Tampoco se han detectado alteraciones en el desarrollo de la semilla en plantas de Arabidopsis con mutaciones KO para los tres genes ETO en esa especie. No se puede descartar, por tanto, que el fenotipo en el mutante de maíz no sea causado por una expresión anómala del gen producto de la inserción de Mu, más que por un simple KO.