Identificación de proteínas cuya expresión se encuentra alterada en condiciones de hipoxia y su posible aplicación como marcadores de la encefalopatía hipóxico-isquémica

Resumen

La encefalopatía hipóxico-isquémica (EHI) es el síndrome producido por la disminución del aporte de oxígeno o la reducción mantenida del flujo sanguíneo al encéfalo. La EHI perinatal en el recién nacido constituye una importante causa de morbi-mortalidad en el periodo neonatal y de discapacidad ulterior en el niño. La ausencia de un diagnóstico eficaz para la EHI hace que la búsqueda de marcadores específicos aparezca como uno de los objetivos fundamentales en el estudio de esta enfermedad. Por este motivo, el objetivo planteado en la tesis ha sido identificar proteínas cuya expresión estuviese alterada en condiciones de hipoxia en sistemas in vitro e in vivo e investigar su posible aplicación como marcadores de la encefalopatía hipóxico-isquémica mediante su estudio en necropsias. La inhibición de la síntesis global de proteínas que tiene lugar durante la hipoxia se produce fundamentalmente a nivel de la etapa de iniciación, siendo la formación de los complejos eIF4F y ternario los principales puntos de regulación. Por otro lado, la situación de hipoxia requiere de la traducción de mRNAs específicos que codifican para proteínas implicadas en el desarrollo de una respuesta adaptativa a la privación de oxígeno. Muchos de estos mRNAs presentan IRES que permiten su expresión en condiciones en las que la traducción cap-dependiente se encuentra comprometida. En primer lugar, se ha desarrollado un modelo de hipoxia in vitro utilizando células PC12 diferenciadas con factor de crecimiento nervioso (NGF) y sometidas a 0.1% de O2. En estas condiciones se observa que la síntesis de proteínas está disminuida y que la muerte celular se produce, fundamentalmente, a través de mecanismos apoptóticos. El análisis de las alteraciones en los niveles y el estado de fosforilación de los factores que intervienen en la regulación de la etapa de iniciación (eIFs) así como el estudio de la traducción IRES (Internal ribosome entry sites)-dependiente demostraron que la traducción cap-dependiente estaba inhibida, principalmente a nivel de la etapa de iniciación, y que la traducción IRES-dependiente se encontraba estimulada. Además, en estas condiciones de hipoxia, se identificaron tres proteínas cuyos niveles estaban aumentados: c-myc, catepsina D (CTSD) y smac-DIABLO. Los estudios realizados en un modelo de isquemia cerebral focal permanente en rata demostraron que, mientras que las alteraciones en la iniciación de la traducción presentan el mismo patrón en los modelos celular y animal, las proteínas identificadas previamente en el modelo celular muestran diferencias en función del sexo. Finalmente, se analizó la expresión de las proteínas CTSD y smac-DIABLO en muestras procedentes de necropsias de neonatos diagnosticados de EHI. En conclusión, se han identificado dos proteínas (Catepsina D y smac-DIABLO) que podrían constituir potenciales marcadores daño celular de Encefalopatía Hipóxico-Isquémica.