Caracterización funcional y estructural de la Endonucleasa G de Leishmania infantum. Exploración de su potencial como diana para el desarrollo de agentes terapéuticos con actividad leishmanicida

Resumo

La familia EndoG está compuesta por un grupo de nucleasas no específicas con dominio ßß¿ de unión a metal presentes en todos los organismos cuyo genoma ha sido secuenciado. Uno de los papeles mejor descritos para este grupo de enzimas es el de migrar de la mitocondria al núcleo para degradar el ADN genómico durante la apoptosis, función que ha sido confirmada para la EndoG de Leishmania infantum (LiEndoG) por nuestro grupo de investigación. No obstante, también se ha demostrado que algunos miembros de esta familia son necesarios para el correcto desarrollo de varios organismos, apuntando hacia un posible papel dual provida/promuerte para este grupo de enzimas. En este sentido, el trabajo llevado a cabo en esta tesis nos ha permitido comprobar que LiEndoG es esencial para el desarrollo y supervivencia de los parásitos, ya que la reducción de su expresión produce un retraso significativo de su crecimiento y hace que su infectividad sobre los macrófagos sea mucho menor. Adicionalmente, hemos podido identificar varios derivados de la 5¿-tritiltimidina con una potente actividad leishmanicida frente a promastigotes y amastigotes axénicos de L. infantum. Dado que los nuevos compuestos generados que tienen actividad leishmanicida son además capaces de inhibir la actividad nucleasa de LiEndoG in vitro, y que el efecto citotóxico producido sobre los parásitos por estos compuestos puede ser contrarrestado cuando se sobreexpresa esta enzima, nuestros resultados apuntan a que LiEndoG es la diana sobre la que actúan estos derivados de la 5¿-tritiltimidina. Por tanto, los resultados de nuestro trabajo sugieren que la inhibición de LiEndoG podría estar produciendo un efecto citotóxico sobre los parásitos, apoyando aún más el papel provida de esta enzima y demostrando el potencial que podría tener como diana terapéutica para el desarrollo de nuevos fármacos con actividad leishmanicida. Finalmente, nuestro grupo de investigación ha desarrollado un nuevo modelo molecular para LiEndoG e identificado varios dominios que confieren a esta nucleasa propiedades prácticamente únicas. El primero de ellos está constituido por una inserción rica en residuos ácidos que conforma un dominio de autoinhibición capaz de regular la actividad de la enzima en función del pH. Adicionalmente, hemos sido capaces de demostrar que la extensión del extremo carboxilo terminal de LiEndoG conforma un dominio que dicta la preferencia que tiene esta enzima por digerir ADN de cadena sencilla. Finalmente, hemos descubierto que: i) LiEndoG existe como un homodímero; ii) el reemplazo de la Ser211 del motivo SRGH del centro catalítico por el aspartato canónico de la mayoría de las nucleasas de esta familia da lugar a una enzima catalíticamente deficiente; y iii) la actividad de la variante S211D puede ser rescatada cuando se reemplaza de forma simultánea la Ala247 por una arginina. En conjunto, nuestros resultados apoyan la idea de que LiEndoG es una proteína multidominio cuya actividad nucleasa puede ser modulada o incluso abolida mediante la introducción de cambios en su arquitectura como consecuencia de las condiciones en el ambiente intracelular y la interacción con otras proteínas.