Regulación de la expresión génica de somatostatina por despolarización con potasio y el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) en cerebro de rata durante el desarrollo

Resumen

La primera parte de este trabajo era estudiar la expresión del gen SS durante el envejecimiento e investigar si el tratamiento con GH podía estimular la expresión e SS en el cerebro de rata vieja y si éste ocurría por igual en las diferentes áreas cerebrales. Hemos confirmado que SS disminuye en cerebro durante el envejecimiento, observándose la disminución en diversas capas de la corteza cerebral, núcleo estriado e hipocampo; y que el tratamiento sustitutivo con GH en administración periférica revierte la disminución de SS. Dado que BDNF es un factor neurotrópico implicado en la regulación de SS, analizamos su expresión observando una disminución de su expresión particularmente en hipocampo y corteza cerebral, cuya disminución revierte tras el tratamiento con GH. Por lo tanto, confirmamos que SS y BDNF cerebral disminuye con la edad y éste disminución está íntimamente relacionada con el déficit de GH observado en el envejecimiento. Para esclarecer el mecanismo mediante el cual GH estimula la expresión de SS y la posible implicación de BDNF en esta regulación [ya que estudios previos de nuestro laboratorio (Villuendas y cols) se demostró de BDNF aumentaba la expresión de SS e intervenía en la inducción del ARNm de SS por despolarización de K+], realizamos estudios de transfixiones transitorias con el promotor de SS unido al gen reportero CAT con el fin de conocer si existía una regulación transcripcional de SS por BDNF. Estos estudios los realizamos en la línea celular PC12trkB y posteriormente en cultivos primarios de células cerebrocorticales con el fin de acercarnos más al modelo ¿in Vitro¿, observando que las células transfectadas con el promotor SS65 (que contienen el elemento CRE), tanto la actividad CAT como luciferasa resultan ser de mayor intensidad que aquellas células transfectadas con el promotor carente del CRE, tras hacer sido tratados ambos grupos con BDNF (50 ng/ml). Estos resultados demuestran por primera vez que existe una regulación transcripcional de SS por BDNF a través del CRE presente en el promotor de SS. Puesto que BDNF ejerce un control transcripcional en la inducción de SS, quisimos estudiar los mecanismos intracelulares que participan en esta activación. Dado que CREB es crucial en la inducción génica de SS, estudiamos su activación por BDNF comprobando la existencia de un pico máximo de activación a los 10 minutos. Mediante el empleo de los inhibidores específicos de cada vía, llevamos a cabo el estudio de las vías que activaban CREB por BDNF. Así para la vía AMPc/PKA utilizamos Rp-cAMPS (20 y 50 µM) y H89 (10, 20 y 40 µM); la vía MAPK, PD098059 (20 y 30 µM); la vía CaMKs, KN62 (10 y 30 µM) y KN93 (10 y 30 µM); y la vía P13¿-kinasa/Akt, LY294002 (5, 10, 20 y 40 µM). Observamos que las vías que activan CREB por BDNF son la vía MAPK, AMPc/PKA y P13¿-kinasa/Akt. Para estudiar cuales de estas vías estaban implicadas en la inducción del ARNm de SS utilizamos los mismos inhibidores específicos de cada vía, H89 (5, 10 y 20 µM), Rp-cAMPS (20 y 50 µM), PD098059 (20 y 30 µM), KN62 (10 y 30 µM) y LY294002 (5, 10, 20 y 40µM); observando que las vía que participan en dicha inducción son las vías MAPK, AMPc/PKA, CaMKs y P13¿-kinasa/Akt; con la consecuente activación de CREB. BDNF además de aumentar los niveles del ARNm de SS, media la inducción del gen SS por despolarización de la membrana con potasio. Por ello, nos planteamos también estudiar los mecanismos intracelulares que median esta inducción de SS por potasio. Estudiamos la activación de CREB por K+, observando una activación con dos picos de máxima activación, a los 5 (activación temprana) y 30 minutos (activación tardía). Para estudiar las vías que participaban en su activación, utilizamos los inhibidores específicos de cada vía Ras/MAPK PD098059 (1, 10 y 100 µM), AMPc/PKA H-89 (5, 10, 20 y 40 µM) y Rp-cAMPs (2,5 , 10 y 20 µM) y de CaMKs KN62 (10, 30 y 45 µM) y KN93 (10 y 30 µM); observando que las vías responsables de la activación temprana de CREB son las vías AMPc/PKA y CaMKs; y de la activación tardía, la vía Ras/MAPK. Para identificar cuales de estas vías estaban implicadas en la inducción del ARNm de SS por K+, utilizamos los mismos inhibidores específicos de cada vía, H89 (5, 10 y 20 µM), Rp-cAMPS(2,5 µM), PD098059 (10µM), KN62 (10, 30 y 45 µM), KN93 (10 µM); confirmando que las vías que participan en la inducción del ARNm de SS por K+ son las vías AMPc/PKA y CaMKs, que son las mismas que participan en la activación temprana de CRB, confirmando por tanto la implicación del CREB activado tempranamente en la inducción del ARNm de SS por K+.