Aproximación empírica al resultado de un tratamiento de reproducción asistida en función del factor masculinoGeneración de un algoritmo pronóstico

Resumen

1.-Introducción El correcto diagnóstico de una muestra seminal ha sido un parámetro de suma importancia a la hora de diagnosticar las causas de una posible infertilidad. Sin embargo, con la aparición de técnicas de reproducción asistida como la Microinyección espermática (ICSI), la tendencia en los laboratorios de RA ha sido de obtener y seleccionar espermatozoides y utilizarlos para la fecundación ovocitaria sin profundizar en la posible patología espermática. En el presente estudio se busca exponer las diferentes alteraciones espermáticas, tanto a nivel morfológico como de calidad genómica y sus consecuencias en el desarrollo embrionario en el laboratorio. Además, con la aparición de nuevos medios y condiciones de cultivo embrionario, al poder mantener los embriones más tiempo en el laboratorio, siendo vigilados por el biólogo, se pueden expresar alteraciones en la evolución de dichos embriones con lo que se podrán identificar las consecuencias de las alteraciones espermáticas de los pacientes. Por otra parte, estudios sobre la calidad del ADN espermático, el estudio de la fragmentación, nos pueden indicar el porqué de la no consecución de la gestación. Al producirse roturas en el ADN, el desarrollo embrionario puede verse afectado, con lo que esto será objeto de estudio. La técnica de MACS (Selección espermática magnética) nos permite excluir espermatozoides que están en proceso de apoptosis debido al ADN fragmentado y que no pueden ser excluidos al realizarse una ICSI simplemente por su morfología. Otras muestras seminales de complicada manipulación y selección, como las obtenidas mediante biopsia testicular serán estudiadas, ya que la selección partirá de un número espermático muy bajo, a lo que hay que añadir que los espermatozoides procedentes de biopsia están en diferentes estadios madurativos. El objetivo final de conseguir un niño en casa cuanto antes se alcanzará transfiriendo embriones de calidad óptima, y para ello deberemos realizar una buena selección embrionaria, tanto en el desarrollo de los embriones como en la elección final de los embriones a transferir. 2.-Hipótesis y objetivos Nuestra hipótesis de partida será que muestras con morfologías espermáticas muy alteradas van a influir en el desarrollo embrionario. Por tanto, es de esperar que en pacientes con muestras alteradas al realizarse el cultivo largo (estadio de blastocisto, día +5 del desarrollo) a partir de día +3 , punto a partir del que la propia carga genética del embrión empieza a expresarse, se reflejen esas alteraciones en el desarrollo embrionario. En pacientes sin espermatozoides en eyaculado (azoospérmicos) en los que se realizó biopsia testicular, se buscó la optimización del cultivo embrionario en el laboratorio. 3.-Material y métodos Para exponer la influencia de la morfología espermática, se generaron dos grupos principales de pacientes, teniendo en cuenta el criterio de Tygerberg, el cual es el recomendado por la OMS(2010) y cuyo valor de referencia se establece en el 4% de formas normales. Los grupos fueron: • Pacientes con morfología gravemente alterada (≤2% de formas normales). Se realizó cultivo embrionario con transferencia en día +3 y día +5 del desarrollo embrionario. • Pacientes con morfología normal (>4% de formas normales). Se realizó cultivo embrionario con transferencia en día +3 y día +5 del desarrollo embrionario. En el caso de que no se consiguiese embarazo en estos ciclos, se indicó una prueba adicional, el índice de fragmentación espermática (IFE) cuyo valor de referencia es del 27%. En pacientes con IFE alterado, se realizó la técnica de MACS. En este caso, se generaron los siguientes grupos: • Pacientes con IFE alterado sometidos a MACS con morfología gravemente alterada. Se realizó cultivo embrionario con transferencia en día +3 y día +5 del desarrollo embrionario. • Pacientes con IFE alterado sometidos a MACS con morfología normal. Se realizó cultivo embrionario con transferencia en día +3 y día +5 del desarrollo embrionario. Por último, se generó un grupo de pacientes diagnosticados de azoospermia obstructiva y sometidos a biopsia testicular (TESE). Se realizó cultivo embrionario con transferencia en día +2,+3 y +5. En todos estos grupos solo se tuvieron en cuenta pacientes con óvulos propios (no ovodonación) y en todos se realizó la Microinyección espermática (ICSI). 4.-Resultados Se realizaron 2261 ciclos de TRA en nuestra clínica, Ginefiv. Los resultados obtenidos fueron resumidos en las siguientes tablas: Día +3 Embriones fecundados Embriones totales Embriones transferidos Tasa de gestación evolutiva Morfología patológica 5,09±1,56 3,79±2,63* 1,74±0,46 32,5%* Morfología normal 5,15±2,447 3,66±1,85* 1,70±0,49 37.35%* Día +5 Embriones fecundados Embriones totales Embriones transferidos Tasa de gestación evolutiva Morfología patológica 8,29±3,35 3,21±1,88* 1,04±0,66 44,4% Morfología normal 8,51±3,39 4,66±2,46* 1,00±070 46,71%* Se ajustaron las comparaciones seleccionando los ciclos en los que se obtuvieron entre 5 y 10 ovocitos en estadio de metafase II, número óptimo para el cultivo y en el cual el número de ovocitos no va a ser limitante para que se exprese el genoma embrionario. 5-10 MII Embriones fecundados Embriones totales Tasa de gestación evolutiva Morfología patológica +3 6,03±1,13 4,39±1,51* 33,49%* Morfología Patológica +5 6,27±1,72 3,45±1,62* 46,56%* 5-10 MII Embriones fecundados Embriones totales Tasa de gestación evolutiva Morfología normal +3 6,05±1,13* 4,15±1,80 43,60% Morfología normal +5 6,63±1,40* 4,07±1,64 45,07% Los pacientes con IFE alterado y tras la realización de MACS se obtuvieron los siguientes resultados: Día +3 IFE MACS Embriones fecundados Embriones totales Tasa de gestación evolutiva Morfología patológica 3,62±1,62* 2,43±1,13* 29,41% Morfología normal 3,23±2,51* 2,00±1,25* 27,27% Día +5 IFE MACS Embriones fecundados Embriones totales Tasa de gestación evolutiva Morfología patológica 7,39±2,86* 3,74±2,03* 39,13% Morfología normal 4,50±2,64* 2,06±1,77* 37,55% En cuanto a pacientes con muestra procedente de biopsia testicular, se obtuvieron los siguientes datos: TESE Embriones fecundados Embriones totales Tasa de gestación evolutiva Día +2 1,83±1,14* 1,91±1,01* 29,5%* Día +3 4,46±2,15* 2,75±1,91* 40,03%* Día +5 7,13±4,33* 3,94±3,94* 56,2%* Dónde los resultados marcados con * representan diferencias estadísticamente significativas (p valor≤0,05). 5.-Discusión El día en que realizar la transferencia embrionaria se ha postulado como un factor de debate en los últimos años con el desarrollo de los medios y condiciones de incubación. No está claro si para todos los pacientes es beneficioso el cultivo largo, y son muchos los centros en los que no se realiza. La morfología espermática también ha estado en discusión, pues han sido muchas las aproximaciones a su valoración, y diversos grupos han establecido diferentes clasificaciones al respecto. Para averiguar si la morfología es un parámetro clave a la hora del desarrollo correcto de un embrión, se estudiaron pacientes con claras patologías a ese nivel y se compararon con pacientes con muestras, a priori, normales. Los resultados obtenidos en cuanto a los ciclos con transferencia en día +3, pudimos observar una diferencia de un 6,6% en la tasa de gestación a favor del grupo con muestras seminales normales (35,76% frente a 42,36%).Con un número similar de embriones conseguidos en cultivo, es la tasa de gestación la que nos refleja la viabilidad de esos embriones. Si observamos los ciclos con transferencia en estadio de blastocisto (día+5) es en el número de embriones obtenido por ciclo donde vimos una gran diferencia: la media fue menor en el grupo procedente de morfologías alteradas. Es decir, hay un mayor número de embriones que no llegan a estadio de blastocisto si proceden de muestras seminales con la morfología gravemente alterada: concretamente una media de 3,21 embriones frente a 4,66 en el grupo de muestras seminales con morfología normal. Esto lo podemos explicar porque son muchos los factores del desarrollo embrionario inherentes al espermatozoide, y es a partir del día +3 hasta la consecución del estadio de blastocisto cuando se van a expresar. Al realizar la selección de casos en los que se obtuvieron entre 5 y 10 metafases II y al observar el desarrollo en las muestras patológicas ocurrió lo mismo: cuando los embriones procedentes de estas muestras se transfirieron en día +3 obtuvimos una tasa de gestación clínica de 33,49% mientras que si se transfirieron en día +5 fue de 46,56%. En el caso de las embriones procedentes de muestras morfológicamente normales observamos que las tasas de gestación en día +3 fue de 43,60% y en día +5 de 45,07%. Por tanto, podemos corroborar que si a un paciente se le diagnosticó una grave patología seminal a nivel de la morfología, en el caso de transferir en día +3 , con un número de ovocitos y embriones similares que en una muestra normal, la tasa de gestación era menor. Sin embargo, muestras alteradas con transferencia en día +5 dan como resultado tasas de gestación similares que las del grupo de morfología normal. Además, debemos incidir, que en cuanto a la media de embriones, cuando las muestras normales se dejaban 2 días más en cultivo, el número fue muy similar (4,15 en día +3 y 4,07 en día +5), mientras que en las muestras patológicas la media de embriones fue mucho menor (4,39 en día +3 frente a 3,45 en día +5). Podemos postular, por tanto, que estos embriones que en día +3 fueron clasificados como viables no generaron embarazo, como ha quedado demostrado en la menor tasa de gestación en día +3 en embriones procedentes de muestras patológicas En cuanto a las muestras con fragmentación del ADN espermático en los que se realizó el MACS, al centrarnos en la tasa de gestación clínica esta fue muy similar en ambos grupos en día +3: 29,41% y 27,27%. Ligeramente menor en pacientes con muestras con morfología normal, lo esperable después de haber obtenido una media de embriones también menor. Esto contrasta con los resultados que habíamos obtenido anteriormente en pacientes en los que no se había realizado el estudio de fragmentación del ADN espermático: en ese caso, los pacientes con morfología espermática alterada la tasa de gestación fue significativamente menor que en pacientes con morfología normal En transferencias en estadio de blastocisto en muestras con IFE alterado, pudimos observar que las tasas de gestación fueron superiores a las obtenidas en transferencia en día +3: 39,13% y 37,55%. Al igual que en el grupo de MACS con transferencia en día +3, no hubo diferencias significativas dependiendo si la morfología estaba alterada o no. Por tanto el MACS se postula como una técnica de selección espermática no solo a nivel de la fragmentación del ADN espermático, sino a nivel de morfología. Por último, en pacientes con muestra seminal procedente de biopsia testicular, aunque la tasa de fecundación fue menor que en ciclos de ICSI, al observar las tasas de gestación vemos que son muy cercanas a los datos de muestra procedente de eyaculado. Si bien es cierto que la tasa de gestación de los embriones transferidos en día +2 fue de 29,5%, la tasa de gestación de transferencia en día +3 fue de 40,03%, muy similar a la tasa de gestación general en día +3, de 39,06%. Si se transfirió en estadio de blastocisto fue de 56,2% mientras que la tasa de gestación general en día +5 fue de 52,48%. Son tasas similares a las muestras procedentes de eyaculado, tal y como han descrito otros grupos lo cual certifica que aunque la tasa de fecundación es mas baja, la tasa de gestación no lo es. 6.-Conclusiones • La morfología espermática afecta al desarrollo embrionario: embriones generados con muestras morfológicamente alteradas alcanzan menor tasa de evolución a día + 5, por tanto, los pacientes con graves alteraciones en la morfología espermática se ven beneficiados de realizar el cultivo largo (estadio de blastocisto). • En pacientes con IFE alterado la influencia de la morfología alterada sobre la tasa de gestación se minimiza: El MACS nos permite excluir espermatozoides con morfología alterada. • En cuanto a los pacientes en los que se realizó una biopsia testicular debido a azoospermia obstructiva pudimos observar que, aunque la tasa de fecundación es menor, la tasa de gestación clínica fue similar a la de pacientes con muestra procedente de eyaculado.