Análisis de la diversidad genética en una colección de poblaciones españolas de "Brachypodium distachyon" como material de base para la mejora y aplicaciones biotecnológica

Résumé

En este trabajo se ha llevado a cabo la evaluación de la diversidad genética que encierra una colección de 23 poblaciones naturales de Brachypodium distachyon recogidas en diversas regiones de la Península Ibérica. Se ha utilizado como referencia dos líneas domesticadas y comercializadas. Esta especie presenta variabilidad en el número de cromosomas por lo que el primer objetivo fue el de caracterizar la constitución cromosómica de cada población y estudiar el origen de tal variación, así como su influencia en la variabilidad genética, distribución eco-geográfica, rasgos morfológicos y comportamiento de las muestras en cultivo in vitro. La evaluación de la respuesta al cultivo in vitro de embriones inmaduros de muestras procedentes de todas las poblaciones se abordó en varios medios de inducción de la embriogénesis somática y de regeneración. El análisis de los cariotipos de cada población, permitió clasificar las poblaciones de la colección de B. distachyon en tres grupos, con 10,20 y 30 cromosomas. En base a los resultados de la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) con las sondas de los genes ribosomales 5SRDNA y 45SrDNA y de hibridación in situ genómica (GISH) con ADN de los tres citotipos, se demuestra el carácter aditivo de la constitución cromosómica de las poblaciones con 2n=30cromosomas a partir de las de 2n=10 y 2n=20. De este modo, las formas de 2n030 serían aloploides originadas por hibridación y duplicación cromosómica de dos formas diploides de cariotipos y número de cromosomas diferentes, 2n=10 y 2n=20. Estas diferencias cromosómicos apuntan a que las formas vegetales que las representan podrían tratarse de especies diferentes del mismo género Brachypodium, lo que obligaría a una revisión taxonómica del género. El estudio del comportamiento en cultivo in vitro se ha realizado en dos fases. En primer lugar se abordó un estudio del comportamiento de los embriones cigóticos inmaduros de todas las muestras de poblaciones de B.distachyon en dos medios de cultivo: MS y MSm, que se diferencian en la fuente de carbono. Del mismo, se puede deducir que existe una amplia variabilidad en la respuesta al cultivo in vitro, que abarca desde poblaciones recalcitrantes a otras con un nivel de respuesta medio-alto, tanto en la fase de producción de callos embriogénicos como en la capacidad de regeneración de brotes verdes. Los resultados no permiten recomendar un medio idóneo para todas las poblaciones. En una segunda aproximación, se eligieron dos poblaciones de cada grupo cromosómico (Bd160 y Zulema', 2n=10; Bd114 y Bd115, 2n=20 y Bd238 y Bd341, 2n=30) para ensayar 9 medios de cultivos que se diferenciaron en el tipo de fitohormona (2,4-D, Piclorán y Dicamba) incorporada al medio y en su concentración. En la fase de inducción de la embriogénesis somática se observó diferencias significativas en el número de callos totales /total de embriones puestos en cultivo (TC), también el análisis de varianza ANOVA aplicado a la variable número de callos compactos/ total de callos (CC) indicó diferencias altamente significativas entre los diferentes genotipos ensayados y señaló la importancia de la interacción genotipo x medio' en el éxito de esta primera fase de cultivo. Los medios BR1, BR2 y BR3 preparados con 2,4-D (1 mg/l, 2mg/l y 4mg/l, respectivamente) fueron los mejores para inducir la embriogénesis somática. Sin embargo, los medios preparados con Piclorán y Dicamba fueron los peores, con unos porcentajes de callos blandos muy altos. Se ha observado que las poblaciones con números cromosómicos superiores Bd238 y Bd341 (2n=30) y Bd114 (2n=20) mostraron una buena capacidad embriogénica. Todos los callos se pasaron a un medio de germinación G1, con el fin de producir plántulas verdes. Las poblaciones con 2n=20 (Bd114 y Bd115) no manifestaron la respuesta esperada en base a su alta capacidad para formar callos embriogénicos. Teniendo en cuenta los resultados de ambos ensayos de cultivo in vitro se destaca la interacción Medio x Genotipo' y el control genético de los mecanismos de inducción de la embriogénesis somática y la regeneración de brotes verdes que parecen estar controladas por sistemas genéticos distintos. El estudio de la diversidad genética interna de cada población y entre las poblaciones se ha llevado a cabo utilizando tres tipos de análisis: proteínas de reserva del endospermo y marcadores moleculares tipo microsatélites (SSR) e inter-microsatélites (ISSR). Los tres tipos de aproximaciones han permitido establecer relaciones se similtud entre las poblaciones. El análisis de la diversidad de las proteínas de reserva del endospermo demuestra el orden creciente de variabilidad genética al aumentar el número de cromosomas de las poblaciones. Se ha llevado a cabo un análisis de similitud utilizando el coeficiente de Jaccard y el agrupamiento de las poblaciones de acuerdo con el método UPGMA. Las poblaciones con el mismo número cromosómico tienden a agruparse entre sí, dentro del mismo clúster, con coeficientes de aproximación variables. Se demuestra la influencia de algunos factores eco-geográficos y climáticos en la distribución de las 23 poblaciones naturales de B. distachyon La aplicación de dos tipos de marcadores moleculares al análisis de la diversidad es revelador de un elevado grado de polimorfismo, tanto interno en cada población como entre poblaciones. Los 156 fragmentos amplificados por los 11 sistemas microsatélites (SSR) estudiadas, permiten una separación perfecta de las poblaciones con respecto a sus números cromosómicos. Los resultados de los 16 marcadores inter-microsatélites (ISSR) seleccionados resultaron especialmente útiles para la estimación de la diversidad intra-poblacional. La variabilidad intra-poblacional e inter-poblacional detectada en las poblaciones analizadas, pone de relieve la amplitud de la base genética disponible en la colección de poblaciones autóctonas españolas de B. destachona. Por el volumen del material analizado y los resultados obtenidos se considera esta colección suficiente y de una gran utilidad potencial para iniciar la selección de líneas útiles para la obtención de cubiertas vegetales de interés agronómico y para aplicaciones biotecnológicas.