Caracterización y función biológica de la lacasa producida por "Streptomyces ipomea" CECT 3341aprovechamiento de su potencial oxidativo para la degradación de contaminantes ambientales

Resumen

Las lacasas son enzimas con actividad fenoloxidasa, pertenecientes al grupo de las oxidorreductasas multicobre caracterizadas por poseer átomos de cobre en su centro activo. Catalizan la oxidación monoelectrónica de una gran variedad de sustancias fenólicas y aminas aromáticas con el oxígeno molecular como aceptor final de electrones. Son enzimas ampliamente distribuidas en la naturaleza y han sido descritas en hongos, plantas, insectos, bacterias e incluso en arqueas. El interés actual de estas enzimas se debe a su gran potencial para ser utilizadas con fines biotecnológicos y/o medioambientales. En este trabajo se ha llevado a cabo en primer lugar, la producción, purificación y caracterización físico-química y cinética de la lacasa recombinante SilA de la cepa Streptomyces ipomoea CECT 3341. Asimismo, se ha analizado la capacidad oxidativa de la enzima en distintos sistemas lacasa-mediador y del microorganismo mediante la inducción de radicales hidroxilo a través de ciclos redox de quinonas. Por último, se ha abordado el estudio de la función biológica de SilA en el microorganismo productor. La estimación del potencial redox de la enzima puso de manifiesto que se trata de una lacasa de potencial redox bajo, al igual que se ha descrito para otras lacasas bacterianas. SilA mostró una moderada estabilidad frente a los agentes caotrópicos ensayados (temperatura y cloruro de guanidinio), demostrándose que el estado nativo de la enzima es más estable que el desnaturalizado. El ensayo de la termoestabilidad cinética permitió determinar la vida media de la enzima que se estimó en 1,3 horas a 95 ºC. Por otro lado, los ensayos conducentes a la elucidación de la estructura tridimensional de SilA no resultaron concluyentes por la imposibilidad de cristalizar la proteína debido, probablemente, a la presencia de dominios hidrofóbicos en el exterior de su estructura, lo que causó interferencias con el procedimiento analítico utilizado. No obstante, mediante comparación de la secuencia de SilA con las secuencias de otras lacasas bacterianas publicadas en las bases de datos, se pudo obtener un modelo teórico tridimensional de la estructura de la lacasa, que permitió elucidar la presencia de dos dominios de tipo cupredoxina, al igual que se ha descrito para otras lacasas de estreptomicetos. La capacidad oxidativa de SilA se puso de manifiesto en actuación conjunta con distintos mediadores frente a tintes textiles de tipo azo y distintos fármacos (fluoroquinolonas y Carbamazepina), obteniéndose los mejores resultados cuando se utilizaron como mediadores la acetosiringona y/o el siringato de metilo, siendo la concentración del mediador y la temperatura factores condicionantes para la eficacia del sistema. Asimismo, se ha demostrado que el micelio de S. ipomoea es capaz de generar radicales hidroxilo gracias a la presencia de la lacasa SilA y de actividad quinona reductasa, los cuales a su vez han resultado muy efectivos en la degradación de los tintes textiles y de los fármacos mencionados. Es importante destacar que el micelio de S. ipomoea permaneció viable tras 24 horas de producción inducida de radicales hidroxilo, lo que avala la idoneidad de este microorganismo para ser utilizado en procesos de biorremediación. El análisis de la toxicidad de los contaminantes de partida y de los productos de degradación obtenidos por ambos sistemas oxidativos demostró que, en algún caso, la toxicidad de los productos de degradación obtenidos era superior a la de los contaminantes de partida, de lo que se infiere la necesidad de llevar a cabo dichos estudios utilizando distintos sistemas de análisis para poder validar los resultados. Por último, con objeto de elucidar la posible función biológica de la lacasa SilA, se llevó a cabo la obtención de un mutante de S. ipomoea no productor de actividad lacasa, mediante disrupción génica. La obtención de dicho mutante permitió conocer la implicación de dicha enzima en la tolerancia al cobre y en la solubilización de la lignina de paja de trigo, funciones que corroboran el interés biotecnológico de la misma.