Estudio de los mecanismos de regulación que operan en las células de transferencia

Résumé

En el grano de maíz las células de transferencia se diferencian a partir de las células periféricas del endospermo en la base del grano, frente las terminales vasculares maternas. Su función posiblemente sea facilitar la entrada de nutrientes durante el proceso de llenado del grano, para lo que desarrollan una serie de invaginaciones de la pared celular que incrementan la superficie destinada al transporte. ZmMRP-1 es un gen que codifica para un activador transcripcional específico de CT que se expresa durante todo el desarrollo de este tipo celular, alcanzando su pico de expresión cuando las células se están diferenciando más activamente. Además, es capaz de transactivar distintos promotores específicos de CT (Meg1, BETL-1, BETL-1 y ZmTCRR-1) y su expresión ectópica en células epidérmicas del endospermo es suficiente para modificar de manera temporal la identidad celular de este tejido hacia células de transferencia. Por todo ello ZmMRP-1 está considerado como un gen clave en la diferenciación de las CT. En esta tesis nos propusimos estudiar las rutas de regulación y señalización en el proceso de inducción y diferenciación de las CT en el endospermo de maíz mediante la caracterización del sistema regulador que pivota en torno a ZmMRP-1. Para diseccionar genéticamente las rutas responsables de la inducción de ZmMRP-1 hemos empleado una colección de Arabidopsis con la construcción ZmMRPprom:GUS mutagenizada con EMS. El screening de la colección mediante tinción histoquímica GUS de plántulas de 7 días tras la germinación nos llevó a identificar 6 líneas mutantes recesivas no alélicas con una expresión GUS alterada. De las 6 líneas identificadas solamente 2, M-12 y M-630, presentan un fenotipo estable. M-12 presenta una expresión ectópica de GUS en la parte aérea de la plántula y una mayor tasa de crecimiento respecto plantas silvestres mientras que la línea M-630, en la que hay un brusco descenso e la expresión de GUS en plántula, tiene un crecimiento ralentizado que afecta a todo el desarrollo y un mayor número de abortos respecto plantas ZmMRPprom:GUS silvestres. El cartografiado fino de la mutación en la línea M-12 mediante el análisis de una población de mapa de 1416 individuos nos ha permitido localizar la mutación en un intervalo de 131 Kb, con 35 genes, en el brazo largo del cromosoma 1 (At1g79120-At1g79470). En el caso de la línea M-630, la mutación causal está ligada al marcador ciw12 en el brazo corto del cromosoma 1. Puesto que el promotor de ZmMRP-1 responde a azúcares y que la inactivación en maíz de CWI2, una invertasa de pared celular específica de CT, afecta seriamente el proceso de llenado del grano quisimos estudiar el efecto de la actividad invertasa de pared celular sobre la inducción del promotor de ZmMRP-1. Para ello analizamos la actividad del promotor de ZmMRP-1 en líneas ZmMRPprom:GUS de Arabidopsis con la actividad invertasa de pared celular alterada. Los resultados indican que el incremento de los niveles de sacarosa, como resultado de una drástica reducción de la actividad invertasa de pared, tiene un efecto inductor sobre la actividad del promotor de ZmMRP-1 en las células de transferencia de esas plantas. Para diseccionar funcionalmente el promotor de ZmMRP-1 realizamos experimentos de expresión transitoria con deleciones seriadas del promotor en las CT que se desarrollan en los cotiledones de Vicia faba. Los resultados indican que las regiones promotoras comprendidas entre -420/-241 y 136/-85 son importante para la expresión del promotor en CT. Ambas regiones comparten una secuencia de 8 pb (AAAGATT) en la que solapan motivos a los que se unen reguladores de respuesta tipo B en Arabidopsis, factores transcripcionales DOF en el endospermo de maíz y un motivo que se localiza en promotores que se activan específicamente en tejidos vegetales que contienen células con morfología de células de transferencia, situados en la frontera entre organismos simbióticos. Con el propósito de identificar genes con capacidad de regular transcripcionalmente a ZmMRP-1 realizamos un experimento de one hybrid utilizando la región -420/-241 de su promotor como anzuelo. Identificamos una factor transcripcional tipo MYB que se une, probablemente, a la secuencia consenso YAAC(G/T)G a la que se unen factores transcripcionales tipo MYB y que encontramos en el fragmento promotor utilizado. Además, hemos identificado, mediante ensayos de two hybrid en levadura, proteínas candidatas a interaccionar con ZmMRP-1 y ZmTCRR-1 a la espera de ser confirmadas en otros sistemas.