Caracterización físico-química y molecular de la Lacasa producida por Streptomyces ipomoea. Evaluación de su potencial biotecnológico

Resumen

Las lacasas son metaloproteínas pertenecientes al grupo de las oxidasas multicobre. Catalizan la oxidación monoelectrónica de un amplio rango de compuestos fenólicos, con la reducción paralela del O2 a H2O2. En este trabajo se presenta la caracterización físico- química y molecular de una nueva lacasa producida por la cepa Streptomyces ipomoea CECT 3341 y se pone de manifiesto su utilidad para su aplicación en varios procesos biotecnológicos. En primer lugar se establecieron las condiciones óptimas de producción de la activada enzimática en cultivo sumergido, alcanzándose los niveles máximos de producción en presencia de galactomanano y asparagina con fuentes de carbono y nitrógeno respectivamente, junto con la adicción de cobre como inductor. Posteriormente se llevo a cabo la purificaión de la enzima y la clonación del gen codificante para estas lacas, que se denomino siA. En la secuencia de este gen se hallaron diversos motivos característicos de las oxidasas multicobre, destacando las cuatro regiones de unión a los átomos de cobre. También se pudo determinar que esta proteína posee únicamente dos dominio de tipo cupredoxina y un péptido señal característico del sistema de secreción TAT; estas propiedades solo se han descrito hasta el momento en otras dos lacasas, producidad igualmente por estreptomicetos. Además, se realizo un estudio comparativo de las regiones de unión al cobre de la lacasa e S. ipomoea con alas de otras oxidasas milticobre de bacterias, observándose importantes diferencias entre las lacasas de dos dominios y el resto de oxidasas multicobre analizadas, lo que sugiere que las lacasas de dos dominios constituyen una nueva familia de lacasas. El gen silA fue sobreexpresado de forma heteróloga empleando como hospedador Escherichia coli obteniendo de este modo, niveles elevados de lacasa recombinante en forma soluble. La purificación de las enzimas nativa y recombinante reveló que se trataba de proteínas homodiméricas. Entre sus características físico-químicas hay que señalar su gran estabilidad frente al pH alcalino y altas temperaturas, su inusual tolerancia a elevadas concentraciones de cloruro sódico y su amplia especificidad de sustrato, siendo ésta dependiente del pH. Destaca especialmente el hecho de que los compuestos fenólicos fueron oxidaos por la enzima a pH alcalino, a diferencia de lo que ocurre con la mayoría de lacasas descritas. El estudio realizado con la lacasa recombinante puso de manifiesto la contribución del cobre en la formación del dimero de la proteína. La lacasa recombinante purificada fue capaz de decolorar un colorante de tipo azo en presencia de acetosiringona como compuesto mediador de la oxidación. Por otro lado, el tratamiento de pasta Kraft de eucalipto con el sistema lacasa-ABTS, produjo la designificación parcial de las fibras, tal como se reflejo en la observación microscópica de las mismas y en la reducción del número Kappa. Este tratamiento supuso asimismo, un ahorro significativo de peroxido de hidrógeno en la etapa de blanqueo, a la vez que proporciono un importante incremento de la blancura del papel resultante.