Modelo teórico de toxicidad de Helicobacter Pylori sobre células de mucosa gástrica

Resumen

INTRODUCCIÓN: La toxicidad por Helicobacter pylori (Hp) es la causa principal de gastritis y está fuertemente asociada con atrofia, ulceración, MALT y adenocarcinoma gástrico. La inducción de muerte celular programada juega un importante papel en la evolución de estas patologías, pero no está del todo descrito el mecanismo por el que se desencadena. OBJETIVOS: Establecer una hipótesis fisiopatológica por la que Hp daña la mucosa gástrica. MATERIALES Y MÉTODOS: Se realizaron cocultivos de la línea epitelial gástrica AGS (ATCC R CRL-1739) con 3 cepas genéticamente diferentes de Hp [ATCC R 51932: cagA-; vacA (s2/m2); ATCC R 700824: cagA+; vacA (s1b/m1); ATCC R 51110: urease-; vacA (s1a/m1)] Los experimentos se llevaron a cabo durante 12, 24 y 48h con diferentes densidades bacterianas (desde 104 a 2x108UFC/mL). Se suplemento con el antioxidante VitE (10-4M) y se estudiaron: 1. Parámetros celulares y mitocondriales relacionados con estrés oxidativo Defensa antioxidante: contenido en glutation (marcaje con mBrB) contenido en NADPH (autofluorescencia celular en UV) Radicales libres: análisis del burst oxidativo (marcaje con la sonda DCFH-DA) contenido mitocondrial en anión superóxido (sonda MitoSOX Red) Oxidación de lípidos mitocondriales (marcaje con NAO) 2. Parámetros estructurales y funcionales de mitocondrias Potencial de membrana mitocondrial (alpha m) (detección con JC-1 y MitoTrackers) Permeabilidad de Transición Mitocondrial por análisis de la apertura de los poros de transición (PTM) (experimentos con Calceína-AM y CoCl2) Análisis de citocromo c (cit c) en fracciones subcelulares (citosólicas y mitocondriales) Análisis del fenotipo de la red mitocondrial (visualizado con NAO) Cuantificación del balance fisión/fusión por análisis de expresión génica de dinaminas (drp-1) y mitofusinas (mfn-2) 3. Parámetros celulares y mitocondriales relacionados con apoptosis Análisis de la morfología nuclear (marcaje con AO y patrón "DNA ladder") Evaluación de la cascada de caspasas por análisis de la proteína caspasa-6, la expresión génica de caspasa-3 y la actividad de caspasa-2 Cuantificación de la expresión génica de genes pro- (bax, bid) y anti-apoptóticos (bcl-2) Los análisis se llevaron a cabo por Citometría de Flujo, Microscopía Confocal, Western Blot, PCR a tiempo real y ELISA. RESULTADOS: Se observó aumento de radicales libres y disminución simultánea de las defensas antioxidantes tanto a nivel celular como mitocondrial. Se cuantificaron niveles elevados de oxidación de cardiolipina y se observó reestructuración de la red mitocondrial desde un fenotipo tubular a un fenotipo fragmentado de mitocondrias aisladas y redondeadas, distribuidas principalmente en la zona perinuclear, con un balance fisión/fusión incrementado. Las mitocondrias experimentaron además pérdida de m y apertura de los PTM. Los niveles de cit c se encontraron elevados en el citosol. Los niveles de caspasas y de genes proapoptóticos estaban aumentados, pero disminuído el de bcl-2; un porcentaje incrementado de células mostraron condensación celular y cuerpos apoptóticos. Todos los resultados fueron significativamente diferentes a los obtenidos en controles y en los experimentos con VitE. CONCLUSIONES: El estrés oxidativo inducido por Hp es el inicio de una cascada de alteraciones que conduce a las células gástricas a una muerte apoptótica vía mitocondrial. Las alteraciones son dependientes de la densidad y del tiempo de infección, pero independientes de las proteínas Ureasa y CagA.