Caracterización molecular del regulador transcripcional ZmMRP-1

Laburpena

El objetivo principal de la tesis es conocer los mecanismos moleculares que operan durante el desarrollo y diferenciación de las células de transferencia (CT) en el endospermo de maíz. Estas células, situadas en la base del endospermo, están especializadas en el transporte de nutrientes desde la planta madre hasta el grano. Entre los genes que se expresan de forma específica en CT se encuentra el factor transcripcional ZmMRP-1. Esta proteina se expresa abundantemente durante los primeros estadios de desarrollo del grano, y además es capaz de activar la expresión de otros genes específicos de este tejido (Gómez E. et al., 2000), lo que sugiere que ZmMRP-1 podría jugar un papel fundamental en el desarrollo y diferenciación de una célula de transferencia. La realización de la tesis se ha dividido en tres puntos fundamentales: 1. Estudio de la interacción de ZmMRP-1 con promotores específicos de CT. El promotor elegido para este estudio ha sido el del gen BETL-1, puesto que se había visto previamente que era capaz de ser transactivado por ZmMRP-1 en un sistema de expresión transitoria en protoplastos de tabaco (Gómez E. et al., 2000). En base a este sistema se diseñaron delecciones 5'--3' del promotor de BETL-1 de forma que se iba acotando la región implicada en la interacción con ZmMRP-1. El análisis de secuencia de la región delimitada revela la existencia de cuatro motivos de 12 pb que han sido ensayados en experimentos de retardo de movilidad electroforética (EMSA) para determinar la afinidad de cada uno de ellos por ZmMRP-1. Además, se han encontrado motivos de secuencia casi idéntica en otros genes regulados por ZmMRP-1 que han sido también probados. 2. Caracterízación funcional de la proteína ZmMRP-1. Se han llevado a cabo 4 estrategias: * Búsqueda de "knock-out", en todas las colecciones de mutantes disponibles de maíz. * Análisis molecular de líneas de maíz anti-sentido para ZmMRP-1. * Producción de líneas de Arabidopsis y tabaco sobre-expresando ZmMRP-1, así como su análisis fenotípico y molecular. * Producción de líneas de Arabidopsis donde ZmMRP-1 se encuentra en fusión transcripcional con el receptor de glucocorticoides, de manera que la entrada de ZmMRP-1 en el núcleo ocurre tras la inducción con Dexametasona. Los efectos de esta inducción se han analizado tanto fenotípica como molecularmente mediante microarrays. Los resultados obtenidos han sido analizados in silico y se han encontrado genes muy interesantos cuyos datos de expresión se han confirmado mediante RT-PCR a tiempo real. 3. Regulación de la expresión de ZmMRP-1. La identificación de un promotor funcional de ZmMRP-1 ha permitido producir líneas "reporter" en cereales, maíz y cebada, y dicotiledoneas, arabidopsis y tabaco, donde la expresión de GUS se encuentra controlada por dicho promotor. El patrón de expresión de GUS dirigido a regiones de descarga del floema sugiere la presencia de algún metabolito común como responsable de la inducción de ZmMRP-1. Para corroborar esta hipótesis se han llevado a cabo ensayos de inducción con azúcares utilizando estas líneas.