New non-viral vectors for sirRNA delivery to inhibit HIV replication

Resumen

Una de las primeras limitaciones del ARN pequeño de interferencia (siRNA) como técnica para la regulación de genes es su efectiva transfección y liberación del siRNA en el interior de las células diana. Los dendrímeros y los polímeros polietilenimina (PEI) son nanopartículas que se han desarollado como vectores no virales para la liberación de oligonucleótidos y fármacos. A través de dos colaboraciones con otros grupos de investigación, hemos tenido acceso a nuevos dedrímeros carbosilano (CBS) y copolímeros PEI unidos a una o más moléculas de polietilenglicol (PEG) con el fin de investigar el potencial que estos vectores tienen en la inhibición de la replicación del VIH mediante la liberación de siRNA. Inicialmente, se han llevado a cabo estudios de estabilidad y dinámica estructural para examinar las características que estas estructuras poseen cuando se acomplejan con siRNA. Los experimentos han mostrado que los CBS protegen a los siRNA de la degradación por RNasas y que la liberación del siRNA es gradual. Ensayos de citotoxicidad de dendriplexes en una selección de tipos celulares han mostrado una concentración máxima de dendrímero segura para ensayos in vitro. Se han llevado a cabo experimentos similares con polyplexes destacando la mejora en la biocompatibilidad lograda tras la unión de los polímeros con PEG. Los polímeros PEI-PEG apenas han tenido efecto en la viabilidad celular. A continuación, mediante el uso de citometría de flujo y de microscopía confocal o de inmunofluorescencia, se ha observado que tanto linfocitos como astrocitos se transfectan con siRNA marcado con un fluorocromo tanto solo como unido a vectores de liberación. Además, ensayos de eficiencia de transfección han ayudado a determinar los mejores ratios de carga y el tamaño y número óptimos de moléculas PEG para conseguir una máxima internalización por las células. Con el fin de usar estos métodos de liberación para alcanzar las células del sistema nervioso central (SNC), se han utilizado dos modelos distintos de barreras biológicas para testar el potencial de los dendriplexes en cruzarlas. El ultimo grupo de experimentos ha consistido en el silenciamiento de genes mediante la liberación de siRNA por estos vectores. Se ha conseguido silenciar el gen GAPDH en casi un 50% tras un corto periodo de incubación con dendriplexes y en un 80% tras tres semanas de tratamiento con poliplexes. El objetivo principal de este proyecto se ha alcanzado cuando la liberación de siRNA por un polímero PEI-PEG ha resultado en una inhibición estable de la replicación del VIH durante quince días a niveles comparables a los del fármaco antirretroviral AZT. En conjunto, nuestros resultados apuntan a la posibilidad de utilizar estos vectores no virales para transfectar y liberar siRNA en linfocitos o atravesar la barrera hemato-encefálica y alcanzar las células del SNC, lo cual mejoraría el uso potencial del ARN de interferencia como terapia alternativa en la infección por el VIH.