Análisis de biomarcadores en el carcinoma de mama: Expresión inmunohistoquímica y valor pronóstico

Resumen

RESUMEN DE LA TESIS: ANÁLISIS DE BIOMARCADORES EN EL CARCINOMA DE MAMA: EXPRESIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA Y VALOR PRONÓSTICO DOCTORANDA: ANGELA BIBIANA ORTIZ OTERO INTRODUCCIÓN El carcinoma de mama (CM) es la patología neoplásica más frecuente en las mujeres occidentales con un alto índice de incidencia global y es la primera causa de muerte asociada a cáncer en las mujeres (Malvezzi et al, 2013). Además de esto, los factores pronósticos de la enfermedad son heterogéneos y hoy en día se conoce que están ligados a factores morfológicos y moleculares propios de la neoplasia. Clásicamente se han utilizado como factores pronósticos de la enfermedad los marcadores clínicopatológicos como el tamaño tumoral, el grado histológico, la afectación ganglionar, entre otros (Cianfrocca & Goldstein, 2004;Esteva & Hortobagyi, 2004;Payne et al, 2008). La clasificación molecular del carcinoma de mama en los subtipos Luminal A, Luminal B, Her2/neu sobreexpresado, similar a las células basales y similar a la mama normal (Perou et al, 2000), en donde los dos primeros grupos expresan receptores hormonales (Receptor de estrógenos RE/Receptor de progesterona RP), el tercer grupo presenta sobreexpresión de la proteína Her2/neu con receptores hormonales negativos y el cuarto grupo se caracteriza por no expresar receptores hormonales ni Her2/neu y expresar genes característicos de las células basales, ha demostrado tener un gran impacto debido a que estos subtipos presentan diferentes comportamiento biológico, pronóstico y vías terapéuticas (Cianfrocca & Gradishar, 2009). Además existen otros factores asociados a las vías de tumorogénesis del CM, como las proteínas reguladoras del ciclo celular, factores de transcripción, proteínas asociadas a la proliferación celular, reguladores de los procesos de apoptosis, entre otros; que son objeto de estudio en busca de nuevos marcadores predictivos y prónosticos de la enfermedad. El RE es un factor pronóstico y predictivo ampliamente reconocido y principal en la subdivisión de los subtipos tumorales (Badve & Nakshatri, 2009;Hammond et al, 2010;Patani et al, 2013). Así mismo el HER2 es un fuerte factor predictivo en el CM debido a que los tumores que expresan HER2 son suceptibles a tratamiento dirigido que ha demostrado ser efectivo mejorando ampliamente la supervivencia libre de enfermedad (SLE) y supervivencia global (SG) de estas pacientes (Gutierrez & Schiff, 2011;Hammond et al, 2010;Wolff et al, 2007). Respecto a otros marcadores los resultados de los diferentes estudios han sido variables por lo cual hoy en día no se ha reconocido su valor pronóstico y/o predictivo y consecuentemente siguen haciendo parte de los objetivos de la investigación en el carcinoma mamario. La técnica de tinción inmunohistoquímica (IHQ) ha permitido la valoración de la expresión de múltiples marcadores celulares (RE, RP, HER2, Ki67, EGFR, CK5) que permiten identificar los diferentes subtipos moleculares del CM, demostrando ser una herramienta eficaz y reproducible para el diagnóstico (Callagy et al, 2003), aunque la correlación no es totalmente precisa. Para asegurarnos una mejor caracterización y tratamiento de las neoplasias mamarias son necesarios nuevos marcadores biológicos que complementen los análisis clínico-patológicos clásicos. OBJETIVOS 1. Analizar la expresión de un amplio número de proteínas implicadas en la vía de RE, la proliferación, la apoptosis y el ciclo celular mediante técnica inmunohistoquímica sobre matrices de tejido en piezas de mastectomía correspondientes a carcinoma infiltrante de mama. 2. Correlacionar los resultados del estudio inmunohistoquímico con: ¿ Los parámetros clinicopatológicos clásicos: edad, tamaño tumoral, grado histológico, y estado de afectación de los ganglios linfáticos regionales ¿ Con los factores predictivos del conjunto IHC4 ¿ Con los subtipos moleculares de carcinoma infiltrante: Luminal A, Luminal B, HER-2 sobreexpresado y Triple Negativo ¿ El seguimiento clínico de las pacientes: supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global MATERIALES Y MÉTODOS Se construyeron 6 matrices de tejido (TMA) con 192 casos diagnosticados en el Hospital Universitario Puerta de Hierro de Majadahonda de carcinoma mamario infiltrante durante los años 2002 al 2012. La selección de casos se realizó aleatoriamente y de todos los casos se revisaron los informes anatomopatológicos, las preparaciones histológicas y las historias clínicas. Para la construcción de los TMA se utilizaron muestras tisulares procedentes de piezas de mastectomía y/o biopsias. Sobre los TMA se realizaron técnicas de inmunohistoquímica de 20 marcadores: RE, RP, receptores de andrógenos (RA), CK19, HER2, p53, Bcl2, Ki67, E-cadherina, FOXA1, GATA3, p27, p21, p16, p63, Rb, Ciclina D1 (CCND1), GCFD15, AKA2, GDF15. Los resultados inmunohistoquímicos fueron valorados por la doctoranda y luego revisados por dos investigadores diferentes utilizando los mismos criterios. Así mismo se realizó técnicas de hibridación in situ para evaluar la amplificación de los genes HER2/neu y CCND1 para la confirmación de la presencia de la amplificación genética. Utilizando los resultados de la valoración de RE, RP, HER2 y Ki67 se clasificaron las muestras en cuatro subtipos tumorales: Luminal A, Luminal B, HER2 Sobreexpresado y Triple Negativo. Para el seguimiento de las pacientes se valoró la SLE y la SG. La SLE se define como el tiempo, en meses, desde el diagnóstico hasta la fecha de recurrencia, última revisión médica, o fallecimiento por enfermedad. La SG se define como el tiempo, en meses, desde el diagnóstico hasta la última revisión médica, o fallecimiento por enfermedad. El punto de corte para el análisis de la supervivencia se estableció el 30 de septiembre del 2013. El análisis estadístico de los resultados inmunohistoquímicos, los datos clínicos e histológicos se realizó utilizando el sistema estadístico SPSS 15.1. Se realizó correlación de todos los marcadores en el estudio con los factores clínico-patológicos, los subtipos tumorales y los resultados del FISH así como entre ellos mismos. RESULTADOS La muestra del estudio incluyó 179 casos, con una media de edad de 57.13 +/-15.61 años (rango entre 28 y 93 años). El tamaño tumoral medio fue 2.84 +/- 1.91cm (rango entre 0.42 y 14.5cm). De las 179 muestras 70 casos (39.1%) eran tumores T1 (menor o igual a 2cm), 96 casos (53.6%) eran tumores T2 (entre 2,1 y 5cm) y 13 casos (7.3%) eran tumores T3 (mayores de 5cm en su diámetro principal). La afectación media de los ganglios regionales fue de 2.4 ganglios afectos +/- 4.44 (rango de 0 a 30 ganglios afectos) y se subdividió en cuatro grupos según la clasificación TNM. Se observó que 85 casos (47.5%) no presentaban afectación ganglionar (N0), 48 casos (26.8%) presentaban de 1 a 3 ganglios con metástasis neoplásica (N1), 26 casos (14.5%) con 4 a 9 ganglios afectos (N2) y 12 casos (6.7%) con más de 10 ganglios con metástasis tumoral o con afectación del ganglio supraclavicular ipsilateral (N3). En el presente estudio encontramos un predominio de los tumores hormonodependientes RE+ y/o RP+, de tipo histológico no específico que expresan E-cadherina (92.2%). La distribución de las muestras según el grupo tumoral fue: 68 casos (38%) se asignaron al grupo Luminal A, 63 casos (35.2%) al grupo Luminal B, 13 casos (7.3%) al grupo HER2 Sobreexpresado y 35 casos (19.5%) al grupo Triple Negativo. Los resultados obtenidos en la valoración de la hibridación in situ para CCND1 fueron: 145 casos (81%) no amplificados, 17 casos (9.5%) con amplificación baja y 17 casos (9.5%) con amplificación alta. En la evaluación del FISH de HER2 se observaron 152 casos (84.9%) no amplificados y 27 casos (15.1%) amplificados. En la distribución de los marcadores IHQ observamos que las valoraciones positivas de HER2, p63, AURKA, GCDFP-15 y GDF15 fueron escasas (20, 15, 32, 40 y 44 respectivamente). Los marcadores que mostraron predominio de las valoraciones positivas fueron RE, RP, RA, Bcl2, FOXA1, GATA3, CCND1, p16, p27 y Ki67, mientras que la expresión positiva y negativa de Rb, p21 y p53 se distribuyó de forma casi equitativa entre las muestras, con aproximadamente la mitad de los casos en cada grupo de expresión. La SG de la serie a los 96 meses (8 años) fue del 62,9%, (IC 95%: 49,38 ¿ 76,42) (Figura 29). De los 179 casos incluidos en el estudio, 36 casos fallecieron y se registraron 49 recaídas hallando un porcentaje de SLE de un 57%, a los 96 meses (IC 95%: 43,09 ¿ 70,91). La media de seguimiento de la serie fue de 44,9 meses con un rango entre 1 y 179 meses. Las altas expresiones de los marcadores FOXA1, GATA3, BCL2, CCND1 y p27, se asociaron a los CIM clasificados como luminales, a las expresiones positivas de RE y RP y a los parámetros clínicos conocidos como de mejor pronóstico como los grados histológicos bajos (GI) y la ausencia de afectación ganglionar (N0). Adicionalmente se observó asociación inversa de los tumores GI con marcadores conocidos como de pronóstico adverso como lo son p16, p53 y HER2. En nuestro estudio los valores altos de Ki67 se asociaron con altos grados histológicos, observándose mayores tasas proliferativas en los tumores peor diferenciados. Los tumores Luminales A de nuestra serie se asociaron a tamaños tumorales T1, bajos y moderados grados histológicos (GI y GII) y en su mayoría no presentaban afectación ganglionar al diagnóstico. En cuanto a los casos del subtipo Luminal B, que comprende un grupo de tumores más heterogéneo donde se incluyen a todos los tumores hormonodependientes que a su vez son portadores de amplificaciones de HER2 y los tumores RE/RP positivos con altos índices de proliferación celular (Ki67>15%), mostraron asociación con los tumores de tamaño intermedio (T2) y grados histológicos mayores que los del subtipo A, distribuyéndose mayoritariamente entre los GII y GIII. A pesar de que en los Luminales B también encontramos asociación con la ausencia de afectación ganglionar, la mayoría de los casos clasificados como N2 (afectación de 4 a 9 ganglios) y N3 (afectación de más de 9 ganglios) se distribuyeron dentro de este subtipo tumoral. En nuestra serie los grupos tumorales HER2 Sobreexpresado y Triple Negativo se asociaron a los tamaños tumorales intermedios (T2), y a los grados histológicos altos (GIII) con ningún caso HER2 Sobreexpresado que fuese GI y tan sólo un caso del grupo Triple Negativo fue GI. Respecto a la afectación ganglionar en ambos grupos la mayor parte de los tumores no presentaban afectaciones ganglionares pero observamos que el 33.3% de los tumores con valoraciones N3 fueron tumores del grupo HER2 y el 30,6% de los N2 pertenecían al subtipo Triple Negativo, evidenciando que estas afectaciones tienen una alta presentación en estos grupos. También encontramos que ambos grupos tumorales se correlacionaban con los alta proliferación celular (Ki67 >15%) y con la expresión negativa de p27 marcador que su sobreexpresión se ha ligado a la vía RE, y que además su baja expresión y negatividad en los carcinomas infiltrantes se ha asociado a pobre pronóstico y peor comportamiento tumoral. Las altas expresiones de p53 y p16 se asociaron al subtipo Triple Negativo. Encontramos asociación de los subtipos HER2 Sobreexpresado y Triple Negativo con la ausencia de amplificaciones de CCND1. Las amplificaciones de CCND1 se distribuyeron mayoritariamente en los grupos luminales, observándose que el 68% (11 casos de 17) de las amplificaciones bajas eran tumores del subtipo A y el 76% (13 casos de 17) de las amplificaciones altas eran tumores del subtipo B. El análisis de los resultados de la correlación entre la hibridación in situ de CCND1 con los marcadores IHQ no mostró diferencias significativas, a excepción de la asociación entre la presencia de altas amplificaciones y tumores con altos niveles de Ki67 (p=0.007). Las amplificaciones de HER2 se asociaron a la negatividad para RP (p<0.001), las expresiones bajas y negativas de Bcl2 (p<0.001) y p27 (p=0.028) y además con la sobreexpresión de Rb (p=0.041). La ausencia de amplificaciones de HER2 se correlacionó con la positividad para RE y RP, con altas expresiones de FOXA1, Bcl2 y p27 y con la negatividad para p63. Hemos observado que los elevados índices de Ki67 se relacionaban de manera significativa con otros marcadores de mal pronóstico o comportamiento tumoral agresivo (HER2, p53, p16, Rb), y se asociaba inversamente con RE, RP, Bcl2 y CCND1. Encontramos correlación directa de Bcl2 con los otros marcadores asociados a los tumores RE+ (RP, CCND1, p27, FOXA1, GATA3 y RA) y de forma inversa con p53 y HER2. Además la negatividad de Bcl2 se asoció al subtipo HER2 Sobreexpresado. La sobreexpresión de p53 se asoció a la alta proliferación celular (Ki67), sobreexpresión de Rb y a la negatividad para RE/RP y p27. Respecto a Rb observamos que la expresión positiva de Rb se asoció a la alta expresión de marcadores asociados a los tumores RE+ (FOXA1, GATA3 y p27) y alta expresión de p21 (proteína regulada por p53). La alta expresión de CCND1 se correlacionó con alta expresión de p27, Bcl2, FOXA1 y GATA3 y la positividad para p21, así como la positividad de CCND1 se correlacionó inversamente con p53. La expresión alta de p21 también se asoció con la alta actividad proliferativa (Ki67) en los CM de tipo luminal (RE+), y con la alta expresión de GATA3, FOXA1 y p27 en toda la serie. Respecto a p16 observamos que la expresión negativa o baja de p16 se correlacionó con la positividad para RE, RP, y con alta positividad de CCND1, GATA 3 y FOXA1. Encontramos una fuerte asociación directa (p<0.001) de la expresión de FOXA1 con los receptores hormonales nucleares (RE, RP y RA) y con los subtipos Luminal A y B. La correlación de FOXA1 con los otros marcadores asociados a la vía de señalización de RE también fue significativa. No obstante, observamos que la expresión de FOXA1 se asociaba inversamente con la expresión de p53 y p16. En nuestro estudio hemos encontrado que la mayoría de los casos AURKA positivos pertenecían a los grupos Luminal B y Triple Negativo. También observamos asociación entre la expresión positiva de AURKA y la expresión positiva de p53 así como correlación directa de la expresión de GCDFP-15 y la expresión de RA. La mejor tasa de SG y SLE a 60 meses se observó en los tumores T1 (85,9% y 87,7% respectivamente), grado histológico I (96,3% y 96,8% respectivamente) y sin afectación ganglionar N0 (88,2% y 78,6% respectivamente). En los grupos de edad encontramos que las pacientes con edades de 40 a 65 años tenían la mejor tasa de SG a 60 meses siendo del 80,1% mientras la tasa de SLE más prolongada se observó en el grupo de edad de pacientes mayores de 65 años (84,5%). Encontramos una mayor tasa de SG y SLE en el subtipo tumoral Luminal A, que presentó un 76.1% (IC 95%: 56.9 - 95.3) de SG y 62.3% (IC 95%: 42.12 - 82.48) de SLE. La menor tasa de SG la encontramos en los subtipos Luminal B y HER2 Sobreexpresado, con una SG de 59.3% (34.02 - 84.58) y 31.7% (IC 95%: 0 - 77.95) respectivamente, La curva de SLE tuvo un comportamiento similar a la de la SG, con porcentajes de 49.7% (8.94 - 90.46) para el subtipo Luminal B y 34.2% (IC 95%: 7.16 - 61.24) en los casos HER2 Sobreexpresado. Los tumores RE+, RP+ y Bcl2 positivos altos tenían la mejor tasa de SG con 80.2% (IC 95%: 70.21 - 90.19) para los casos RE+, 78.6% (IC 95%: 67.43 - 89.77) para los RP+ y 80.9% (IC 95%: 70.12 - 91.68) para los tumores con expresión alta de Bcl2, mientras que los grupos de tumores RE-, RP- y las bajas expresiones de Bcl2 tuvieron peor SG. En cuanto al estudio de SLE en estos tres marcadores, las curvas se comportaron de forma similar a las curvas de SG, con mejores tasas de SLE en los tumores RE+, RP+ y con expresión alta de Bcl2. Otros marcadores que tuvieron asociación significativa con la SG fueron p16 y GDF15. Observamos que los grupos con expresión positiva de GDF15 y las altas expresiones de p16 tenían la menor tasa de SG a 96 meses con un 40.2% (IC 95%: 4.53 - 75.87) para los tumores GDF15 positivos y un 39.9% (IC 95%: 15.6 - 64.2) para los casos con alta positividad para p16. En el análisis de la SLE con otros marcadores encontramos diferencias significativas de la relación con las pruebas de FISH para CCND1 y HER2, pero no con las pruebas IHQs para los mismos marcadores. En ambos casos las amplificaciones del gen (altas amplificaciones de CCND1 y HER2 amplificado) obtuvieron la peor tasa de supervivencia, con una SLE a 60 meses de 48.5% (IC 95%: 22.24 - 74.76) en los casos con amplificaciones altas de CCND1 y de 49.9% (IC 95%: 27.76 - 72.04) en los tumores HER2 amplificados. Encontramos que los carcinomas con alta expresión de GATA3 presentaban mejores tasas de SLE a 60 meses (79.4% con IC 95%: 69.41 - 89.39) que aquellos tumores con expresiones bajas, intermedias o negativos para GATA3. CONCLUSIONES 1. En nuestra serie, las variables clásicas, grado I, tamaño tumoral T1 y la ausencia o baja afectación ganglionar se asociaron a una mejor supervivencia. 2. La clasificación en subtipos tumorales mediante parámetros inmunohistoquímicos nos permite diferenciar neoplasias con diferente comportamiento biológico, agresividad y supervivencia. ¿ Los subtipos HER2 sobreexpresado y Triple Negativo presentaron una peor supervivencia global. ¿ La mayor supervivencia correspondió al subtipo Luminal A. ¿ La expresión de RE y RP se asoció a bajo grado nuclear y ausencia o baja afectación ganglionar 3. La expresión del antígeno Ki67, marcador de proliferación celular, se asocia con mayor grado histológico. 4. Los altos índices de Ki67 se asociaron a marcadores de mal pronóstico: HER2, p53, p16, y Rb. 5. En nuestra serie encontramos una estrecha correlación entre la expresión alta de HER2 y la presencia de amplificación del gen, este dato apoya la utilidad de la metodología actual (IHC y FISH restringido) para seleccionar a este grupo de pacientes. 6. Los tumores HER2 son neoplasias altamente proliferativas. En nuestra serie encontramos asociación con: ¿ Alto grado histológico ¿ Alto índice de proliferación (Ki67) ¿ Alteraciones de las proteínas del ciclo celular consistentes en: - Ausencia de expresión de p27 - Ausencia de expresión de p21 - Sobreexpresión de Rb 7. Los CM HER2+ son tumores más agresivos. En el análisis de supervivencia nuestros casos HER2+ (tanto sobreexpresados como amplificados) se asocian a SLE acortada. Este resultado justificaría tratar con antiHer2 no solo a los casos que sobreexpresan HER2 por amplificación del gen, sino también a los casos que muestran sobre expresión ligada a otras anomalías génicas con polisomías. 8. La expresión CCND1 se asocia estrechamente con la expresión de RE en los CIM, es decir de los cánceres mamarios de tipo luminal. Dentro de este grupo se observa que: ¿ Las expresiones bajas se asocian a factores pronósticos favorables (GI y GII y N bajos). ¿ Por el contrario las altas expresiones de CCND1 se asocian a alto índice de proliferación. Los CIM de tipo RE+ con alta expresión de CCND1 podrían ser un grupo de mal pronóstico dentro de este subtipo de CM. 9. La amplificación génica alta de CCND1 se asocia a una menor SLE por lo que en nuestra serie se comporta como un factor de mal pronóstico. 10. La alta expresión de p53 se observa en los CM del subtipo Luminal B y Triple Negativo. 11. En nuestra serie la expresión de p53 no se asocia a supervivencia aunque se relaciona con factores pronósticos desfavorables como alta proliferación y sobreexpresión de Rb. 12. Las valoraciones negativas de Rb se asocian al subtipo Triple Negativo y Luminal A. 13. La expresión de la proteína p16 se asocia a una menor diferenciación celular en todos los subtipos tumorales de CIM, asociándose especialmente al grupo Triple Negativo. 14. El grupo Triple Negativo muestra un perfil de expresión caracterizado por ser Rb negativos con alta de p16 y sobreexpresión de p53. 15. La expresión de la proteína p16 tiene un papel pronóstico en el CIM. Su alta expresión se asocia a factores de riesgo adversos (sobreexpresion de p53 y alta proliferación) y conlleva una menor SG. 16. La alta expresión de p21 se asocia con un alto índice de proliferación, especialmente en el grupo de tumores RE+. Este dato sugiere que la alta expresión de p21 podría ser un marcador de pronóstico adverso en los CM RE+. 17. La pérdida de expresión de p27 se asocia con tumores de alto grado y afectación ganglionar N3, indicando que podría tratarse de un marcador pronóstico adverso. En nuestro estudio de SLE observamos que los casos con perdida de p27 mostraban una tendencia (p=0.054) a tener peor SLE. 18. FOXA1 se asocia estrechamente la expresión de receptores hormonales, es por lo tanto un marcador del CM de tipo luminal. Se expresa en un grupo de tumores HER2+ y es sistemáticamente negativo en el grupo Triple Negativo. 19. La alta expresión de FOXA1 se asocia con bajo grado histológico dato que apoya que FOXA1 es un factor de diferenciación en los tumores mamarios. 20. GATA3 se asocia fuertemente a la expresión de receptores hormonales reflejando su papel regulador en la trascripción de dichos receptores. 21. GATA3 también se expresa en los tumores no luminales, en este dato se basa su papel como marcador útil en el CM metastático. 22. La alta expresión de GATA3 es un factor pronóstico favorable en el CIM. Se correlaciona clínicamente con la ausencia o baja afectación ganglionar y se asocia a mejor SLE. 23. AURKA es un marcador de proliferación que en nuestra serie se asocia a los CIM del tipo Luminal B y Triple Negativo, ambos caracterizados por tener altos índices de proliferación. 24. La expresión de AURKA y la expresión de p53 están asociadas en el CIM, lo que sugiere que en los CM asociados a alteración de p53 se pierde el control de AURKA. 25. La expresión de GCDFP-15 en los CM de nuestra serie se asocia con la expresión de RA, apoyando su papel como marcador de diferenciación apocrina. 26. La baja incidencia de expresión de GCDFP-15 encontrada en nuestro estudio no apoya su utilización como marcador de linaje mamario. 27. La expresión de GDF15 es un factor de mal pronóstico en nuestra serie, asociándose a menor supervivencia global.