Study of the shelterin component TRF1 as an anti-cancer target

Resumen

Telomeres are specialized nucleo-protein structures at the end of chromosomes that protect them from degradation, repair activities and from fusing to other chromosome ends. The protein component of the telomere is called the shelterin and its main role is to maintain telomere structure and integrity, preventing genomic instability. Telomeres are elongated by the telomerase, a specialized enzyme which expression is very restricted in the adulthood. As a result, telomere shortening occurs within each cell division through the life of an organism. Dysfunctional telomeres, either owing to critical shortening or disruption of the shelterin complex, activate a DNA damage response, which eventually results in cell growth arrest, senescence and/or apoptosis, leading to a reduction of the regenerative potential of the tissues. For those reasons, telomere dysfunction is considered a main driver of aging but also a tumor suppressor mechanism. Mice deficient for the telomerase component Terc and mice deficient for the shelterin component Trf1 represent good models to study telomere dysfunction. Indeed, those mice show a high burden of DNA damage and cell growth arrest, leading to premature aging for Terc-deficient mice and to perinatal death for Trf1-deficient mice. In both mouse models, the additional abrogation of p53 ameliorated the phenotypes associated to accelerated aging and the lethality, but triggered cancer development. In this thesis, we aimed to address two issues: firstly, to analyze the role of the DNA damage response component CHK2 in the signalling of dysfunctional telomeres in vivo; and secondly, to test TRF1-mediated telomere dysfunction as a possible strategy for cancer therapy. To address the role of CHK2 in the signalling of dysfunctional telomeres, we generated doublydeficient mice for Chk2 and either Terc (Chk2-/- Terc-/-) or Trf1 (Trf1¿/¿ K5Cre Chk2-/-). We show that Chk2 deletion improves Terc-associated phenotypes, including lifespan and age-associated pathologies. Similarly, Chk2 deficiency partially abolishes perinatal mortality and attenuates degenerative pathologies of Trf1¿/¿ K5Cre mice. In both cases, we show that those effects are mediated by a significant attenuation of p53/p21 signalling pathway. Our results demonstrate a role for CHK2 in the in vivo signalling of dysfunctional telomeres. To test TRF1 as a possible target for cancer therapy, we generated a conditional deletion of Trf1 in the lung cancer mouse model K-RasG12V, both in a p53-proficient and p53-deficient genetic background. Trf1 abrogation fully impaired K-RasG12V-induced lung tumorigenesis in the presence of p53. In the absence of p53, Trf1 deletion delayed tumor onset and impaired progression to malignancy, increasing mouse survival. The anti-tumorigenic effect of Trf1 deletion was accompanied by induction of telomeric DNA damage, apoptosis, decreased proliferation, G2-arrest, and endoreduplication. These results were validated in xenograft and allograft models by downregulation of TRF1 in cell lines derived from already established p53-deficient KRas G12V mouse and human lung carcinomas. In addition, we generated a conditional whole-body Trf1 deletion in adult mice during more than 1.5 months and showed that this transient TRF1 deficiency did not impact on mouse survival and viability. Together, these results demonstrate that Trf1 deletion effectively impairs the growth and progression of lung cancer without severe effects in normal tissues. Induction of TRF1-mediated acute telomere dysfunction can be considered as a potential new therapeutic strategy for lung cancer. Los telómeros son estructuras nucleo-proteicas especializadas que se encuentran en el extremo de los cromosomas, y que los protegen de degradación, de actividades de reparación y de fusionarse con otros extremos cromosómicos. El componente proteico del telómero se llama shelterina y su papel principal es mantener la estructura e integridad del telómero, evitando la inestabilidad genética. Los telómeros son elongados por la telomerasa, una enzima especializada cuya expresión está muy restringida en la edad adulta. Como consecuencia de esto, en cada división celular se produce un acortamiento telomérico, a lo largo de la vida de un organismo. Los telómeros disfuncionales, bien debido a acortamiento telomérico por debajo de una longitud crítica, o bien debido a la disrupción del complejo shelterina, activan una respuesta frente al daño del ADN, que finalmente resulta en parada del ciclo celular, senescencia y/o apoptosis, llevando a una progresiva pérdida de la capacidad regenerativa de los tejidos. Por estas razones, la disfunción telomérica está considerada como unos de los principales agentes de envejecimiento, pero es también un mecanismo supresor de tumores. Ratones deficientes en el componente Terc de la telomerasa o en el componente Trf1 de la shelterina constituyen buenos modelos para estudiar la disfunción telomérica. En efecto, estos ratones presentan una alta carga de daño al DNA y una parada de ciclo celular, que conducen a un envejecimiento prematuro en los ratones deficientes en Terc y a una muerte perinatal en el caso de los ratones deficientes en Trf1. En ambos modelos de ratón, la deleción adicional de p53 alivia los fenotipos asociados al envejecimiento y la letalidad, pero promueve la tumorogénesis. Esta tesis tuvo por objeto abordar dos problemáticas: la primera fue analizar el papel de CHK2, un componente de la respuesta frente al daño en el ADN, en la señalización de telómeros disfuncionales; y la segunda, testar la disfunción telomérica mediada por TRF1 como una posible estrategia para la terapia anti-cáncer. Para elucidar el papel de CHK2 en la señalización de los telómeros disfuncionales, generamos dos ratones doblemente deficientes en Chk2 y a la vez en Terc (los ratones Chk2-/- Terc-/-) o bien en Trf1 (los ratones Trf1¿/¿ K5Cre Chk2-/-). Hemos demostrado que la deleción de Chk2 mejora los fenotipos asociados a la deficiencia de Terc. De manera similar, la deleción de Chk2 abole parcialmente la mortalidad perinatal y atenúa las patologías degenerativas de los ratones deficientes en Trf1. En ambos casos, mostramos que estos efectos son mediados por una atenuación significativa de la señalización de las vías p21/p53. Nuestros resultados muestran que CHK2 juega un papel en la señalización in vivo de los telómeros disfuncionales. Para testar TRF1 como una posible diana para terapia anti-cáncer, generamos una deleción condicional de Trf1 en el modelo murino de cáncer de pulmón K-RasG12V, tanto en un fondo genético p53 competente como en un fondo deficiente para p53. La deleción de Trf1 impide la tumorigenesis inducida por K-RasG12V en el fondo genético competente para p53. Además, en un fondo genético deficiente para p53, la deleción de Trf1 retrasa la aparición de tumores e impide la malignificación, aumentando la supervivencia de los ratones. El efecto anti-tumorogénico de la deleción de Trf1 se acompaña de inducción de daño al ADN telomérico, apoptosis, reducción de la proliferación, parada del ciclo celular en G2 y endo-reduplicación. Estos resultados se validaron en modelos de alotransplante y xenotransplante, disminuyendo los niveles de TRF1 en líneas celulares derivadas de carcinomas ya establecidos K-RasG12V p53-/- humanos y de ratón. Adicionalmente, se delecionó Trf1 en todo el organismo adulto durante más de 1,5 meses y se demostró que esta deficiencia parcial y transitoria en Trf1 no afecta a la supervivencia ni a la viabilidad del ratón. En conjunto, estos resultados demuestran que la deleción de Trf1 obstaculiza eficazmente el crecimiento y la progresión del cáncer de pulmón sin efectos adversos graves en los tejidos normales. La inducción de una disfunción telomérica aguda mediada por TRF1 podría ser considerada como una nueva estrategia terapéutica potencial para el cáncer de pulmón.