Identificación de péptidos y fármacos inhibidores basados en un nuevo mecanismo de inactivación para p38 MAPK

Resumen

La vía de señalización de p38 MAPK puede ser activada por diferentes estímulos como inflamación o estrés oxidativo, y está implicada en multitud de procesos celulares como proliferación, diferenciación, apoptosis y supervivencia mediante la regulación de la expresión de diversos genes, incluyendo citoquinas proinflamatorias. El desarrollo de un inhibidor potente, selectivo y seguro para p38 ha sido un objetivo perseguido por la ciencia básica y la industria farmacéutica durante los últimos años que no se ha conseguido principalmente por falta de selectividad y efectos secundarios. El descubrimiento en nuestro laboratorio de un nuevo mecanismo de inhibición de p38alpha mediante la fosforilación por GRK2 (quinasa de receptores acoplados a proteínas G) en el residuo treonina 123, situado a la entrada del surco de anclaje de p38, nos ha permitido desarrollar una estrategia alternativa de inhibición dirigida a este dominio. El surco de anclaje es un dominio exclusivo de las MAPK que aporta afinidad y especificidad hacia sus sustratos y moduladores. En este trabajo hemos descubierto que la fosforilación de p38 por GRK2 puede bloquear la interacción de p38 con sustratos y activadores. Igualmente, hemos demostrado que GRK2 también puede fosforilar a la isoforma p38beta2 en la serina 123. El mutante de p38beta2 que imita la fosforilación por GRK2 fosforila con menos eficiencia aquellos sustratos que interaccionan con p38 a través del surco de anclaje. Además, este mutante muestra una capacidad catalítica alterada sobre sustratos independientes del surco de anclaje. Adicionalmente, hemos demostrado que GRK2 fosforila preferentemente a p38 en estado inactivo y que PP2A puede revertir in vitro esta fosforilación. Según estos resultados, hemos desarrollado una serie de péptidos diseñados a partir de los motivos-D de diversas proteínas que interaccionan con p38 incluyendo MKK6, MK2 y MEF2A para intentar inhibir la actividad y/o la activación de p38. Algunos de estos péptidos mostraron actividad inhibitoria sobre p38 in vitro y en células en el rango micromolar. El más eficaz fue el diseñado a partir de MEF2A fusionado con el péptido transportador de membrana TAT, y cuya secuencia fue modificada introduciendo una cisteína para intentar establecer un puente disulfuro con la cisteína 119 de p38. El péptido resultante, TAT-MEF2AxCys, mostró una potencia superior al péptido original de MEF2A, probablemente debido a la formación de este enlace, ya que el efecto inhibitorio es atenuado en presencia de un agente reductor. Este péptido inhibió la actividad de p38 in vitro con una IC50 de 3,7microM y bloqueó completamente la secreción de TNFalpha en la línea monocítica humana THP-1 a una concentración de 10microM y con una IC50 de 3microM. La sustitución de los aminoácidos L por sus enantiómeros D, siendo así resistentes a proteasas, mantuvo el efecto inhibitorio. Sin embargo, ambos péptidos redujeron la viabilidad de las células THP-1 a concentraciones no mucho mayores que las requeridas para la inhibición. Como aproximación alternativa, hemos identificado compuestos inhibidores de p38 seleccionados mediante cribado virtual dirigido al surco de anclaje de p38. Algunas familias de compuestos mostraron actividad inhibitoria de la ruta de p38 in vitro y en células. Entre ellas, la familia de benzo-oxadiazoles, en concreto el compuesto FGA-19, bloqueó completamente la actividad de p38 y la secreción de TNFalpha en células THP-1 a una concentración de 10microM, con una IC50 de 1,8microM y con una ventana de dos órdenes de magnitud entre las dosis inhibitorias y las dosis tóxicas medias. Es interesante resaltar que ambos, péptido TAT-MEF2AxCys y el compuesto FGA-19, pueden inhibir eficazmente p38 en un modelo murino de hiperalgesia inflamatoria, reduciendo la sensibilidad al dolor de los ratones, durante al menos 5 días, a niveles similares a los encontrados en los ratones control, con una concentración menor y un efecto más prolongado que el de inhibidores establecidos de p38 competitivos para el ATP.