Interactions of p1b, the silencing suppressor protein from cucumber vein yellowing virus, with plant factors that contribute to its biological functions

Resumen

En los últimos años, se han realizado grandes avances en biología molecular que han permitido destramar desconocidos procesos biológicos de gran importancia en las interacciones virus-hospedador. Uno de estos procesos es el denominado Silenciamiento por RNA o Interferencia por RNA (RNAi) que tiene como objeto, el control en la expresión génica, y en último termino, regular la producción de proteínas de la célula. Este proceso queda integrado en un complejo entramado de mecanismos de regulación que controlan una gran variedad de tareas fisiológicas relacionadas con el desarrollo ontogénico, la adaptación al entorno, la integridad y mantenimiento de la estabilidad genética, así como con la defensa frente a ácidos nucleicos invasores, entre los cuales se encuentran los genomas virales. El sistema de silenciamiento por RNA cumple pues una función antiviral ancestral, posiblemente muy anterior a otros diferentes mecanismos de defensa descritos con anterioridad, detectando la presencia de formas replicativas invasoras, eliminando las moléculas de ácidos nucleicos foráneos mediante su degradación dependiente de secuencia e inmunizando el tejido adyacente y distal por medio de la amplificación y translocación de pequeñas moléculas de ácido ribonucléico (siRNA) portadoras de la información digital para el reconocimiento de su diana. Como consecuencia se dice que los virus, son pues, inductores y dianas del sistema del silenciamiento. Sin embargo, la lucha por la supervivencia ha favorecido una carrera bio-armamentística en la que los virus han desarrollado estrategias para permitir su evasión de los sistemas de defensa. Una de esas estrategias fue la evolutivamente reciente incorporación de funciones para suprimir el silenciamiento por RNA por parte de las proteínas virales. Estos supresores virales del silenciamiento buscan boicotear la maquinaria del silenciamiento celular inhibiendo así la defensa antiviral. Sin embargo, al ser esta función una adquisición evolutiva reciente, las proteínas RSS virales han de desarrollar funciones adicionales tanto fundamentales como accesorias durante el ciclo viral imprimidas con anterioridad. Las restricciones de tamaño en los genomas virales, imponen una obligada dependencia de los procesos celulares del huésped en reclutar las funciones moleculares necesarias para el conjunto de procesos virales. Por este motivo, las proteínas virales poseen capacidades multifuncionales que emplean en los diversos requerimientos del ciclo viral en asociación con factores del huésped. Las diversas interacciones entre los RSS virales y factores del huésped vinculan a estas proteínas en numerosos procesos celulares y moleculares. El estudio de las interacciones de los RSS virales con factores celulares del huésped puede ayudar a entender no sólo los mecanismos de acción de la supresión del silenciamiento, sino además otras funciones todavía desconocidas asociadas a estas proteínas y relacionadas con el ciclo viral. En esta tesis se realiza una búsqueda por doble híbrido en levaduras y purificación de proteínas mediante resina de afinidad a calmodulina de proteínas del huésped que interaccionan con el supresor del silenciamiento P1b codificado en el genoma de el virus del amarillamiento de las venas del pepino (CVYV). Además, de manera paralela se realiza un estudio en plantas de Arabidopsis infectadas con un vector de expresión viral basado en el virus de la Sharka que expresa la proteína P1b funcional en un contexto viral con objeto de identificar tanto proteínas diferencialmente acumuladas en la firma proteómica del huésped infectado, como factores de trascripción que pudieran estar afectando a la infección del virus. Como resultado de estos escrutinios se seleccionaron un grupo de factores del huésped para analizar su capacidad de interacción con la proteína P1b utilizando diversas técnicas moleculares y de microscopía óptica con objeto de caracterizar factores celulares necesarios para sus funciones virales. Las proteínas del huésped identificadas, una helicasa nuclear (PRH75), una esterol C-8-isomerasa (HYDR1) y la isoforma del factor de iniciación de la traducción de pepino (eIF(iso)4E), podrían estar relacionadas con funciones de traducción y de RSS viral. Además mediante un estudio de inmunomarcaje por microscopia electrónica y ensayos de co-localización con microscopía confocal se localiza a la proteína P1b en el citosol de células infectadas de pepino, donde podría tener un rol en los cuerpos de producción de siRNAs en asociación con la proteína de la cápside viral.