Obtención de compuestos bioactivos a partir de subproductos agroalimentariosExtracción, caracterización química y evaluación de su actividad frente a Alzheimer

Resumen

El Alzheimer es una enfermedad causada por la neurodegeneración progresiva de la estructura y la función del cerebro, que provoca un deterioro de las actividades psicomotrices, los procesos cognitivos, el razonamiento, la memoria y el lenguaje y se exacerba durante el envejecimiento de los individuos. Esta enfermedad no sólo conduce al detrimento de la calidad de vida de quien la padece sino también de su entorno familiar debido al impacto afectivo y económico que representa. La variedad y complejidad de los factores detonantes de esta enfermedad ha impedido por el momento el hallazgo de una cura, por lo cual hasta la fecha, el Alzheimer, así como otras enfermedades neurodegenerativas, se considera progresiva e incurable y los tratamientos farmacológicos solo están enfocados a ralentizar el progreso o en atenuar los síntomas. Por esta razón, la prevención a través de hábitos saludables y componentes de la dieta, así como la búsqueda de tratamientos terapéuticos a base de productos naturales cobra una creciente importancia. En el presente trabajo de investigación se implementó un enfoque multianalítico para estudiar el efecto neuroprotector de fitoquímicos bioactivos presentes en residuos de dos cadenas alimentarias de importancia económica y social: las hojas de olivo (que corresponde aproximadamente al 25% de la biomasa producida en la cadena productiva del aceite de oliva (Olea europaea L.)) y el epicarpio de tamarillo (que representa entre el 8 y el 15% de un fruto tropical nativo de la región Andina de América del Sur, conocido como tamarillo o tomate de árbol (Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt)). En relación con la hoja de olivo, numerosas publicaciones científicas han identificado los polifenoles como el grupo mayoritario dentro del total de compuestos presentes en este residuo. No obstante, esta importante biomasa también posee otros metabolitos minoritarios como los terpenos, que fueron los compuestos objetivo considerados en esta investigación. Se desarrolló un proceso dinámico de extracción con dióxido de carbono supercrítico (scCO2) acoplado a adsorción/desorción para lograr un fraccionamiento selectivo de los compuestos de interés. El estudio del comportamiento de diferentes adsorbentes comerciales en una cinética de extracción a 30 MPa, 60°C, flujo de solvente de 9 L/min CO2, cada 20 min hasta 120 min, permitió obtener fracciones enriquecidas en diferentes clases de terpenos de una manera selectiva. La naturaleza del adsorbente, su selectividad hacia determinadas familias de terpenos y el porcentaje de recuperación, fueron los parámetros analizados en el proceso de extracción. Tanto las fracciones que fueron eluyendo en los diferentes tiempos, como aquella que quedó retenida dentro del material adsorbente, se caracterizaron químicamente mediante la aplicación de técnicas analíticas avanzadas de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-Q-TOF-MS). Por otra parte, el potencial neuroprotector de todos los extractos se estudió a través de la capacidad inhibitoria de las enzimas colinérgicas (acetilcolinesterasa (AChE) y butirilcolinesterasa (BChE)) y de la enzima lipoxigenasa (actividad anti-inflamatoria) y de la actividad antioxidante (ABTS•+) y la inhibición de especies reactivas de oxigeno (ROS) y de nitrógeno (RNS) a través de ensayos ORAC y radical óxido nítrico (NO•), respectivamente. Adicionalmente, para el extracto de hoja de olivo que presentó un mayor potencial neuroprotector, se llevó a cabo el estudio de la permeabilidad de sus compuestos mayoritarios a través de la barrera hematoencefálica y su toxicidad frente a las líneas celulares HK-2 y THP-1. Por otra parte, se evaluó la actividad del mencionado extracto en la línea celular humana de neuroblastoma SH-SY5Y, empleada como modelo in vitro para estudiar trastornos neurodegenerativos y, a través de un exhaustivo estudio lipidómico, se determinó el posible mecanismo molecular involucrado en la neuroprotección observada. Finalmente, la eficacia neuroprotectora de este extracto se confirmó en un estudio in vivo con una cepa transgénica de Caenorhabditis elegans (CL4176) modelo de Alzheimer que expresa el péptido β-amiloide humano. A través de un proceso dinámico de extracción/adsorción/desorción se logró determinar que las sílicas favorecen la recuperación de mono y sesquiterpenos poliinsaturados; la alúmina promueve la retención de diterpenos, mientras que la naturaleza altamente cristalina de las zeolitas favorece la recuperación de triterpenos. Adicionalmente, el adsorbato obtenido a partir de la arena de mar fue el extracto que arrojó los resultados más promisorios en términos de neuroprotección, con valores de inhibición de las enzimas AChE y BChE (IC50= 144.43 y 183.82 µg/mL extracto, respectivamente), LOX (IC50= 104.82 µg/mL extracto), ABTS (IC50= 82.59 µg/mL extracto), ROS (IC50= 18.27 µg/mL extracto) y RNS (IC50= 1036.86 µg/mL extracto). Esta fracción no presentó toxicidad en las líneas celulares HK-2 y THP-1 a la concentración máxima de 40 µg/mL. El tratamiento aplicado en la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y a la concentración máxima (40 µg/mL) permitió observar que el extracto seleccionado no altera la viabilidad celular, ejerciendo además un efecto protector frente al agente tóxico de Aβ42. La caracterización química de los extractos de hoja de olivo arrojó una identificación tentativa de 40 terpenos y terpenoides, los cuales se clasificaron de acuerdo con el número de isoprenos presentes en su estructura química. Dentro de los monoterpenos (C10) destacaron el cimenol y el timol; entre los sesquiterpenos (C15) los más abundantes fueron el γ-elemeno y el germacreno; mientras que el α-tocoferol, hexahidrofarnesil acetona y fitol fueron los diterpenos (C20) más representativos y el eritrodiol, uvaol, β-amyrin y escualeno destacaron entre los triterpenos (C30). El estudio sugirió que el potencial neuroprotector de esta fracción es atribuible a la presencia de triterpenos altamente bioactivos, especialmente del grupo de los pentacíclicos, no obstante, se observó una mayor permeabilidad de los terpenos hexahidrofarnesil acetona, α-tocoferol y β-amyrin a través de la barrera hematoencefálica. El estudio lipidómico realizado a las células SH-SY5Y inoculadas con el péptido Aβ42 identificó más de 250 lípidos intracelulares; en aquellas células tratadas con el extracto de hoja de olivo enriquecido en triterpenos se evidenció un incremento en los niveles de fosfatidilcolinas y fosfatidiletanolaminas frente a las células control, lo cual sugiere un potencial efecto protector de los triterpenos y abren una ventana de oportunidad para futuras investigaciones en éste ámbito. Finalmente, la evaluación in vivo empleando una cepa transgénica de C. elegans estableció que a una dosis de 50 µg/mL se presentó el efecto protector más significativo del extracto frente a la parálisis de este gusano modelo de Alzheimer. Por otra parte, la extracción con líquidos presurizados (PLE) fue la técnica empleada para la obtención de compuestos fenólicos de interés a partir del epicarpio de tamarillo (TE). Un diseño central compuesto con superficie de respuesta determinó que el mayor contenido de fenoles (92.09 mg GAE/g extracto), flavonoides (4.40 mg Q/g extracto) y carotenoides (107.15 mg CE/g extracto) se obtuvo a unas condiciones óptimas de extracción de 15 MPa, 180 °C, 20 min y 100% EtOH como fase extractante. La caracterización química mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (UHPLC-Q-TOF–MS/MS), identificó que los ácidos fenólicos del grupo de los hidroxicinámicos (cafeico, clorogénico y rosmarínico), flavonoides (quercetina y rutina) y carotenoides como el β-caroteno, eran los principales metabolitos responsables del potencial neuroprotector de la fracción optimizada, con valores de actividad inhibidora de las enzimas colinérgicas de AChE y BChE (IC50= 97.46 y 85.46 µg/mL extracto, respectivamente), LOX (IC50= 48.30 µg/mL extracto), ABTS (IC50= 6.33 µg/mL extracto), ROS (IC50= 2.54 µg/mL extracto) y RNS (IC50= 599.00 µg/mL extracto). Adicionalmente, esta fracción no exhibió toxicidad a concentración máxima de 120 µg/mL en las líneas celulares HK-2, THP-1 y de neuroblastoma SH-SY5Y. Los resultados derivados de estos trabajos realizados durante la Tesis Doctoral han dado lugar a 4 artículos de investigación originales publicados en revistas científicas internacionales del área de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, además de un capítulo de libro.