Análisis funcional de los factores de transcripción cdf1 y cdf3 y su implicación en la regulación del metabolismo del nitrógeno y del carbono

Resum

El nitrógeno es un macronutriente esencial cuya disponibilidad en el suelo es crucial para el crecimiento de las plantas y la productividad de los cultivos. El nitrato es la principal fuente de nitrógeno inorgánico para las plantas terrestres. Sin embargo, su baja disponibilidad es, a menudo, un factor limitante para el crecimiento de las plantas en la mayoría de ecosistemas, debido a diversos factores abióticos y bióticos como el consumo llevado a cabo por los microorganismos, el lixiviado y la erosión del suelo. El nitrato además de macronutriente, es también una importante molécula señalizadora que regula la expresión de una gran variedad de genes que modulan diversos aspectos del metabolismo, crecimiento y desarrollo de las plantas. La eficiencia en el uso del nitrógeno es un carácter multigénico que implica diferentes órganos y procesos metabólicos, fundamentalmente al metabolismo de compuestos de carbono y nitrógeno, entre los cuales se han descrito múltiples interacciones. A pesar de que existe actualmente un amplio conocimiento sobre el metabolismo primario del carbono y nitrógeno, su regulación y coordinación, tanto en condiciones normales como en respuesta a condiciones ambientales adversas, son procesos aún poco conocidos. Distintos modelos de regulación génica en Arabidopsis indican la existencia de redes complejas implicadas en la respuesta conjunta al control del balance de carbono y nitrógeno en plantas. Esta regulación suele residir en complejas redes transcripcionales controladas por factores de transcripción, sin embargo la estructura de dichas redes, los mecanismos moleculares y los factores implicados aún no han sido caracterizados completamente en plantas. El trabajo descrito en esta tesis tiene como objetivo investigar el papel regulador de dos factores de transcripción tipo Dof, CDF1 y CDF3, en la respuesta a la disponibilidad de nitrógeno, así como su función en la regulación del balance carbono/nitrógeno, mediante la realización de distintos análisis moleculares y funcionales. Se ha demostrado que CDF1 y CDF3 cambian sus niveles de expresión en respuesta al ayuno de nitrógeno y a tratamientos de nitrato. Los análisis fenotípicos de las líneas de pérdida de función para los genes CDF1 y CDF3, mostraron que ambos exhiben efectos en el crecimiento y arquitectura de raíz principal y las raíces laterales dependiendo del nitrato disponible, mientras que la sobreexpresión de CDF1 y CDF3 mostraron un incremento de la biomasa de la planta bajo distinta disponibilidades de nitrógeno. Así mismo, los análisis de expresión de las líneas de pérdida y ganancia de función indicaron que CDF1 y CDF3 regulan la expresión de un grupo de genes importantes en la respuesta a nitrato, como Glutamina sintetasa 1, Glutamato sintetasa 2, Nitrato reductasa 1 y los transportadores de nitrato NRT2.1, NRT2.4 y NRT2.5, así como genes implicados en la asimilación de carbono, como Piruvato quinasa 1 y Fosfoenolpiruvato carboxilasa 1. Por otro lado, el estudio de las redes reguladoras en las que participan ha puesto de manifiesto que CDF1-3 interaccionan con otros factores relacionados con distintos aspectos del desarrollo, senescencia y señalización sistémica de nitrato. Análisis fenotípicos y genéticos realizados con múltiples mutantes obtenidos entre los factores de interés han puesto de manifiesto que CDF1/3 juegan un papel importante pero diferente en las vías de señalización local y sistémica en respuesta a nitrato en Arabidopsis. Por último, se ha evaluado el uso de CDF1 y CDF3 como herramienta biotecnológica para incrementar la productividad y la eficiencia en el uso del nitrógeno en un cultivo hortícola importante como es tomate (Solanum lycopersicum L.). SUMMARY Nitrogen is an essential macronutrient whose availability in soil is crucial for plant growth and crop productivity. Nitrate is the main source of inorganic nitrogen for land plants. However, it is usually limiting in the majority of the ecosystems, due to a variety of biotic and abiotic factors like microbial consumption, water leaching and soil erosion. Besides a macronutrient, nitrate is also a signal molecule that regulates the expression of a variety of genes that modulate many aspects of metabolism, growth and plant development. Nitrogen use efficiency is a multigenic trait that involved several metabolic processes in different plants organs that are essentially based on C and N compounds. Although we have an accurate picture of the primary metabolism of these compounds, little is known about their regulation and coordination at the plant level. Different models of gene regulation in Arabidopsis indicate the existence of complex networks involved in the coordination of carbon/nitrogen response. This regulation involves complex transcriptional networks controlled by transcription factors, however, the structure of these networks, the molecular mechanisms and the factors involved remain largely unknown. The work described in this thesis aims to investigate the regulator role of two Dof-type transcription factors, CDF1 and CDF3, in plant responses to nitrogen availability, as well as its functions in the regulation of C/N balance. It has been shown that CDF1 and CDF3 expression levels change in response to nitrogen starvation and nitrate treatments. Phenotypic analysis of CDF1 and CDF3 loss of function lines revealed that both genes exhibit effects in plant growth and root architecture depending on the nitrate availability, whereas CDF1 and CDF3 overexpression showed increased biomass under nitrogen poor and rich conditions with an improved root development. Furthermore, expression analyses of CDF1 and CDF3 loss- and gain of function lines indicated that CDF1 and CDF3 regulate the expression of an important set of nitrate responsive genes including, Glutamine Synthetase 1, Glutamate Synthase 2, nitrate reductase 1 and nitrate transporters NRT2.1, NRT2.4 and NRT2.5, as well as carbon assimilation genes like PK1 and PEPC1. On the other hand, the study of regulatory networks in which participates has shown that CDF1/CDF3 interact with other transcription factors related to different aspects of development, senescence and nitrate systemic signaling. Phenotypic and genetic analyzes performed with multiple mutants obtained among the interest factors have shown that CDF1/CDF3 play an important, but different role, in response to nitrate. Finally, the use of CDF1 and CDF3 as a biotechnology tool to increase productivity and nitrogen use efficiency has been evaluated in an important horticultural crop such as tomato (S. lycopersicum L.).