Mejora de protocolos de regeneración por embriogénesis somática en pino piñonero

Laburpena

El pino piñonero (Pinus pinea L.) es una especie forestal nativa de la cuenca mediterránea de alto valor ecológico, como medio de protección de costas y estabilización de dunas continentales, así como económico por sus semillas comestibles. Las plantaciones forestales de producción intensiva podrían aliviar la gran demanda de productos forestales de calidad. Los programas de mejora genética en España de esta especie, considerada como frutal, se dirigen principalmente a la mejora del rendimiento de semilla mediante el cultivo en huertos injertados. Para ello sería conveniente el desarrollo de variedades de portainjertos adaptados a diferentes condiciones ambientales. La embriogénesis somática (ES) como biotecnología para la propagación clonal, se considera una herramienta indispensable en el desarrollo de variedades y plantaciones forestales. La regeneración de plantas por ES se ha conseguido en varias coníferas de interés económico, y la producción industrial en masa de embriones somáticos ha requerido el desarrollo de técnicas de cultivo en suspensión del tejido embriogénico en biorreactores. Para maximizar la eficiencia de esta biotecnología, se requiere la optimización de las condiciones de cultivo en cada una de las etapas de su desarrollo. El establecimiento de marcas epigenéticas inducidas por el medio ambiente conforma una memoria epigenética en las plantas que afecta la expresión a largo plazo de los rasgos adaptativos. La ES se podría utilizar para producir plantas con una impronta que las acondicione para responder a diferentes tipos de estrés. La metilación de las citosinas del ADN es uno de los procesos principales que subyacen a estas marcas epigenéticas. El pino piñonero se caracteriza por su muy baja variación genética pero alta plasticidad adaptativa, relacionada con altos niveles de variación epigenética. Las condiciones de cultivo, temperatura y disponibilidad hídrica, podrían modificar el perfil de metilación de citosinas en líneas embriogénicas de pino piñonero. Se ha obtenido la regeneración de plantas de pino piñonero por ES a partir de embriones cigóticos inmaduros; sin embargo, esta especie se ha mostrado recalcitrante a la respuesta embriogénica. Entre las principales limitaciones se encuentran las bajas frecuencias de inducción y su variabilidad entre años, así como la baja producción de embriones somáticos con morfología normal en las líneas embriogénicas generadas. La solución de los problemas que se plantean en las etapas de inducción, proliferación y diferenciación-maduración de embriones somáticos podría venir a través de la caracterización del explanto inicial y de las variaciones de las condiciones de cultivo habituales. La inducción de embriogénesis secundaria en embriones somáticos, procedentes de cultivos que han perdido su capacidad para formar embriones con morfología normal, podría ser un sistema de reactivación de las líneas embriogénicas. El desarrollo de cultivos en suspensión de líneas embriogénicas podría incrementar la producción de embriones somáticos. En el presente trabajo de tesis, aunque se han utilizado varias familias de semillas de polinización abierta y diferentes condiciones de cultivo, no se han podido mejorar las frecuencias de inducción previamente descritas, confirmándose la recalcitrancia del pino piñonero a la respuesta embriogénica. Se ha obtenido una ligera mejora en la producción de embriones en medios suplementados con determinados carbohidratos. El aumento de la temperatura desde la fase de proliferación a la de maduración estimuló la maduración. Cultivos mantenidos a 28ºC durante la proliferación y maduración produjeron mayor número de embriones en una de las líneas embriogénicas. La menor disponibilidad hídrica durante la proliferación redujo la producción de embriones. Las masas generadas por embriogénesis secundaria mostraron una capacidad para producir embriones similar a las masas procedentes de los cultivos envejecidos. Los cultivos embriogénicos en suspensión incrementaron la producción de biomasa. Un moderado estrés hidrodinámico y una menor concentración de reguladores durante la proliferación mejoraron la producción de embriones somáticos. El perfil de metilación del ADN, determinado por marcadores MSAP, detectó diferencias entre genotipos y entre distintas condiciones de temperatura y disponibilidad hídrica en uno de los genotipos. Algunos de los marcadores MSAP mostraron un aumento de intensidad de bandas desde las masas en proliferación a los embriones somáticos aislados, lo cual sugiere un mayor grado de desmetilación asociado con el proceso de diferenciación.