Fidelity of human immunodeficiency viruses type 1 and type 2 reverse transcriptases in DNA synthesis reactions using DNA and RNA templates

Resumen

El síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) está causado por el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2, respectivamente). La mayoría de los fármacos antirretrovirales aprobados clínicamente para su uso contra la infección por el VIH actúan sobre la retrotranscriptasa (RT) viral. La RT es una enzima multifuncional con actividad ADN polimerasa dependiente de moldes ARN y ADN, así como con actividad ribonucleasa H. Los inhibidores de la RT análogos a nucleósido constituyen el eje central de las terapias actuales contra ambos tipos de VIH. En la RT del VIH-2, la combinación de cambios de aminoácido K65R, Q151M y M184V confiere resistencia a todos los análogos a nucleósido aprobados. Cabe destacar que en RTs de VIH-1 muy divergentes, la mutación K65R confiere por sí misma >8 veces mayor fidelidad en la síntesis de ADN. En esta Tesis, hemos determinado la fidelidad intrínseca para la síntesis de ADN dependiente de moldes de ADN de la RT de tipo salvaje (WT) del VIH-2, grupo A, cepa ROD y de las RTs mutantes K65R y K65R/Q151M/M184V. Nuestros resultados mostraron que estos cambios tienen un efecto relativamente pequeño (menos de 2 veces) en la selectividad de nucleótido de la RT del VIH-2ROD. Una conformación diferente de la horquilla β3-β4 en las RTs del VIH-1 y VIH-2 probablemente podría explicar los diferentes efectos de K65R. Además de su importancia en la infección natural, las RTs también se utilizan ampliamente en biotecnología por su capacidad de sintetizar ADN complementario utilizando ARN como molde. Se ha estudiado ampliamente la fidelidad intrínseca de la síntesis de ADN dependiente de ADN. En ensayos genéticos basados en la expresión del gen lacZα del fago M13mp2, las RTs WT del VIH- 1, grupo M, subtipo B mostraron tasas de error >10 veces mayores que el virus de la leucemia de ratón (MLV) y el virus de la mieloblastosis de aves (AMV). En esta Tesis se han determinado las tasas de error de síntesis de ADN dependiente de ARN para varias RTs, incluyendo las de los virus WT del VIH-1BH10, VIH-1ESP49, AMV y MLV, y las RTs de alta fidelidad del VIH-1ESP49 con los cambios K65R y K65R/V75I. Nuestros resultados muestran diferencias de menos de 2 veces en la fidelidad de estas RTs, con valores de tasas de error entre 2.5×10-5 y 3.5×10-5. Estos resultados fueron consistentes con la existencia de un umbral de error de la transcripción, generado por la ARN polimerasa al sintetizar el ARN utilizado como molde en el ensayo. Se logró una reducción modesta pero consistente del umbral de error al disminuir el pH y la concentración de Mg2+ de la reacción de transcripción. A pesar de las limitaciones del ensayo, concluimos que las RTs del VIH-1BH10 y VIH- 1ESP49 son menos precisas cuando se copian moldes de ADN que de ARN. El análisis de los espectros de mutación dependientes de ARN reveló una mayor tendencia a introducir deleciones largas al inicio de la retrotranscripción en todas las RTs del VIH-1, excepto la del doble mutante K65R/V75I. Los datos proporcionados por secuenciación masiva muestran también diferencias similares en la fidelidad entre las RTs del VIH-1BH10 y del doble mutante K65R/V75IESP49.