Nanoestructuras de carbono y de óxido de zinc como base para el desarrollo de métodos de determinación de biomarcadores de enfermedades metabólicas

Resum

El trabajo de tesis desarrollado tiene como objetivo principal la aplicación de distintos nanomateriales, en concreto nanopartículas de diamante (DNPs) y nanoestructuras de óxido de zinc (ZnO), en el desarrollo de biosensores electroquímicos 2 D y 3 D, y de métodos ópticos de análisis para la determinación de biomarcadores de interés, como la glucosa y el lactato. Además, se ha tratado de modificar estos nanomateriales de forma asimétrica mediante una novedosa técnica electroquímica, la electroquímica bipolar, combinada con radiación ultravioleta (BPE&UV), para la obtención de nanomateriales con diferente reactividad en su superficie (Janus). Para el desarrollo de los biosensores 2D basados en la nanoestructuración de electrodos de oro con DNPs se han seguido distintas metodologías. En primer lugar, se desarrollaron biosensores basados en la inmovilización por adsorción directa tanto de las DNPs como de las enzimas, sobre electrodos de oro. En este caso se emplearon DNPs de distinto tamaño, de 9 nm (DNPs9) y de 4 nm (DNPs4), y como elemento de reconocimiento, la glucosa oxidasa o la lactato oxidasa. Como paso previo, se trató de averiguar los grupos funcionales presentes en la superficie de los tipos de DNPs mediante espectroscopía de infrarrojo (IR), no existiendo gran diferencia entre ambos. A continuación, se estudió el comportamiento electroquímico de las DNPs adsorbidas sobre un electrodo de oro. Se comprobó que, aunque las DNPs tienen un carácter aislante, muestran actividad electrocatalítica como consecuencia de la presencia de grupos funcionales con insaturaciones en su superficie. Igualmente se estudió la respuesta de los electrodos modificados con DNPs a un mediador redox, el hidroximetil ferroceno (HMF). El electrodo modificado con las nanopartículas grandes (DNPs9/Au) mostró un proceso redox quasi reversible correspondiente a la oxidación-reducción del HMF a +0.30 V. Sin embargo, el modificado con las nanopartículas pequeñas (DNPs4/Au), además de la respuesta redox característica del HMF a +0.30 V, mostró un proceso irreversible a un potencial de +0.15 V. Con el fin de estudiar el origen de este pico se obtuvieron los voltamperogramas cíclicos de DNPs4/Au en HMF a distintas velocidades de barrido de potencial. De los resultados obtenidos se concluyó que este pico irreversible se debe a un proceso de adsorción. Se desarrollaron los biosensores de glucosa y lactato mediante inmovilización de la enzima (glucosa oxidasa o lactato oxidasa) sobre la plataforma electroquímica DNPs/Au mediante adsorción directa. Se caracterizaron las distintas etapas del desarrollo de los biosensores mediante espectroscopía Raman, AFM, SEM y voltamperometría cíclica. Posteriormente, se obtuvo la respuesta de los biosensores GOX/DNPs/Au y LOx/DNPs/Au desarrollados frente a la adición de glucosa y lactato, respectivamente, en presencia de un mediador redox en disolución, el hidroximetil ferroceno (HMF). El empleo del HMF permite reducir el sobrepotencial y evitar así posibles interferentes. Los biosensores desarrollados presentan una buena reproducibilidad y estabilidad con límites de detección de 61.6 µM y 15.0 µM, para glucosa y lactato respectivamente, y de 134.6 µM y 5.3 µM para los biosensores con las nanopartículas de 4 nm. En todos los casos los resultados alcanzados son comparables con los que se pueden encontrar en la bibliografía para biosensores de lactato y glucosa fabricados de forma similar. El biosensor LOx/DNPs4/Au permite trabajar a +0.15 V, un potencial bastante bajo, con la ventaja que esto supone a la hora de evitar posibles interferencias. Por otro lado, se desarrolló un biosensor 3D basado en la integración de las nanopartículas de diamante, en este caso DNPs9, y el elemento de reconocimiento biológico, la LOx, en una red tridimensional de tipo sol-gel usando como precursor el 3-mercaptopropiltrimetoxisilano, MPTS (LOX/DNPs9/MPTS/Au). El uso del proceso sol-gel destaca como una forma de preparación de materiales porosos híbridos orgánico-inorgánicos, que permiten crear un entorno adecuado para retener la estructura y actividad de la enzima encapsulada en ellos. Se realizó el estudio morfológico mediante AFM de todas las etapas de la modificación del electrodo. Posteriormente, se realizó también el estudio de la respuesta electroquímica frente a lactato en presencia de HMF, obteniéndose un límite de detección de 16 µM. Cabe destacar que, como era de esperar, en este caso, se obtiene una gran mejoría, del 50 %, en la estabilidad del biosensor al compararlo con los biosensores desarrollados previamente, modificados con DNPs mediante adsorción directa. Finalmente, se aplicaron los biosensores desarrollados para la detección de lactato (LOx/DNPs9/Au, LOx/DNPs9/MPTS/Au y LOx/DNPs4/Au) en muestras reales, concretamente vino y suero humano comercial. Para la determinación de los analitos, se utilizó el método de adición estándar. Los resultados se compararon con los obtenidos por un kit enzimático comercial, obteniéndose valores muy similares por ambos métodos, comprobándose así, su aplicabilidad a la determinación de lactato en muestra real. Otro de los nanomateriales utilizado en este trabajo es el ZnO. El ZnO es un semiconductor tipo-n con un salto de banda de 3.3 eV, un punto isoeléctrico alto, de 9.5, y presenta fotoluminiscencia (PL) a temperatura ambiente. En este trabajo se ha aprovechado la fotoluminiscencia del ZnO para el desarrollo de un método óptico de análisis de lactato, rápido y que no necesita del uso de marcadores. El ZnO se sintetizó mediante Transporte Químico de Vapores (Chemical Vapor Transport (CVT)), por el grupo del Profesor José Luis Pau, del Departamento de Física Aplicada de la UAM, con el que existe una colaboración. Los nanohilos sintetizados se caracterizaron morfológicamente mediante SEM, observándose nanohilos de un tamaño aproximado de entre 15 y 30 µm. También se observó la presencia de otro tipo de estructuras tipo tetrápodo. Se estudió la estabilidad en el tiempo de la PL de los nanohilos de ZnO (ZnO NWs) en medio acuoso. En este caso, la señal PL de los ZnO NWs resultó ser poco estable en el tiempo debido a la baja solubilidad del ZnO en medio acuoso. Sin embargo, es necesario trabajar en medio acuoso tamponado para mantener la actividad de la enzima. Se estudió la interacción de los ZnO NWs con la LOx mediante absorción UV visible, observándose un efecto hipocrómico que corrobora la interacción de los ZnO NWs con la LOx. Finalmente, se obtuvieron los mejores resultados formando el bioconjugado ZnO NWs-LOx mediante incubación durante dos horas, en agitación suave. Se obtuvieron los espectros PL del bioconjugado en ausencia y en presencia de concentraciones crecientes de lactato, empleando una longitud de onda de excitación de 330 nm. Como control, se realizó el mismo experimento con una dispersión de ZnO NWs, sometido al mismo proceso que se realiza para la formación del bioconjugado. Comparando los espectros obtenidos para los ZnO NWs y para el ZnO NWs-LOx se observó un efecto de amortiguación en la PL del bioconjugado, debido al peróxido de hidrógeno generado en la reacción enzimática mediada por la LOx. Se estudió la variación de la PL del bioconjugado frente a cantidades crecientes de lactato obteniéndose una respuesta lineal con un límite de detección de 0.54 µM. La reproducibilidad del método es moderada debido a la baja solubilidad del ZnO. Por otro lado, tanto las DNPs como los nanohilos de ZnO se han empleado en una modalidad novedosa de la electroquímica, la electroquímica bipolar combinada con UV (BPE&UV), con la intención de obtener la modificación asimétrica de las nanoestructuras. La electroquímica bipolar es un fenómeno basado en la polarización de un material conductor en un campo eléctrico. Si esta diferencia de potencial es suficiente, se pueden dar reacciones redox en los extremos del objeto, generando una reactividad diferente en la superficie de objetos conductores (partículas Janus) de forma inalámbrica. La diferencia de potencial necesaria para generar la polarización del material depende del tamaño de este, por tanto, para tamaños del orden de nanómetros, la diferencia de potencial que se necesita para generar la polarización es muy elevada. Sin embargo, está descrito que la aplicación de la electroquímica bipolar junto con la exposición simultánea a radiación ultravioleta (BPE&UV) permite superar esta limitación de la técnica. Lo que genera la reacción de oxidación-reducción en este caso no es la diferencia de potencial aplicada, sino la radiación. En este sentido, se ha aplicado esta metodología a nanopartículas de diamante de un tamaño entre 3 y 10 nm, dopadas con boro con el fin de mejorar su conductividad (DNPsB), y a los nanohilos de ZnO. El objetivo es conseguir la modificación asimétrica, tanto de las DNPsB como de los nanohilos de ZnO, con un depósito metálico de oro. En primer lugar, se fabricó una celda electroquímica formada por un compartimento de reacción con la parte de arriba abierta, para la aplicación de la radiación UV, y dos compartimentos para los electrodos. Los electrodos se fabricaron con minas de grafito. Se optimizaron las condiciones de trabajo, obteniendo el mejor resultado tras aplicar la BPE&UV al 50% de potencia de la lámpara y aplicando un potencial de 0.5 KV durante 10 s. Tras el tratamiento electroquímico, las DNPsB se observaron mediante AFM, empleando como soporte placas de mica con el fin de comprobar la presencia del depósito metálico de oro, observándose un cúmulo de DNPsB cubierto con un deposito rugoso, consistente con un depósito metálico. La microscopía SEM pone de manifiesto la presencia de agregados de nanopartículas que presentan algunas zonas más brillantes que otras y que podrían corresponder a depósitos metálicos. Sin embargo, no se puede afirmar que exista una modificación asimétrica de las DNPsB. Igualmente se trató la modificación asimétrica de los nanohilos de ZnO. Para ello se emplearon dos estrategias diferentes. Una de ellas consistió en la preparación de una suspensión de ZnO NWs, conteniendo la sal de oro, HAuCl4 1mM, que se puso en el compartimento de reacción. En este caso no es necesaria la inmovilización de los nanohilos, como en el caso de las nanopartículas ya que, al aplicar el campo eléctrico, se espera que los nanohilos se orienten paralelos a este. La otra estrategia consistió en la modificación de una placa de mica con una dispersión de ZnO NWs, que se introdujo en la base del compartimento de reacción, con el fin de maximizar las opciones de observar nanohilos modificados tras el experimento. Posteriormente se cubrió con la sal de oro. En las condiciones óptimas de trabajo, la imagen de SEM obtenida tras realizar el experimento, confirmó la presencia de un nanohilo modificado con un depósito de oro en sólo uno de sus extremos. Estos resultados establecen la pauta para confirmar la electroquímica bipolar como una herramienta para lograr la modificación asimétrica de nanomateriales con depósitos metálicos.