Electroforesis capilar de isoformas de glicoproteínas en fluidos biológicos como potenciales marcadores de cáncer de próstata

Resumen

El objetivo general de esta Tesis Doctoral es desarrollar metodologías analíticas que permitan aislar PSA y AGP de diferentes fluidos biológicos y obtener los perfiles de electroforesis capilar (CE) de ambas glicoproteínas para realizar un estudio exploratorio de la utilidad de estos perfiles de proteínas como potenciales marcadores de cáncer de próstata (PCa). Para lograr este objetivo, se han llevado a cabo las actividades que se describen a continuación: Tanto para AGP como para PSA, ya se habían desarrollado previamente en nuestro laboratorio métodos de CE. En el caso del PSA, se modificó el método de separación por CE-UV durante esta Tesis con el fin de evitar falta de precisión entre lotes de capilares y mejorar la resolución entre isoformas. Un profundo estudio de los parámetros involucrados en esta separación electroforética, permitió obtener la resolución de 10 isoformas de PSA, mediante acondicionamiento ácido del capilar y el empleo de tampón de separación a pH 8,0 y conteniendo urea 3 M. Con el fin de disponer de una mayor información sobre el potencial de la CE en la separación de isoformas de PSA aislado de muestras de interés, se estudió la correspondencia entre los perfiles electroforéticos de isoformas de PSA obtenidos por electroforesis bidimensional en gel (2-DE) y CE. Para ello, en colaboración con el grupo de la Dra. Peracaula de la Universidad de Gerona, se analizaron y compararon los distintos perfiles obtenidos por 2-DE y CE para PSA procedente de diferentes muestras (PSA procedente de orina, PSA de alto pI, fracciones de PSA obtenidas por fraccionamiento OFFGEL, etc). Durante esta Tesis se han desarrollado metodologías de purificación de PSA a partir de orina y suero y de AGP de orina y se han completado los estudios de los procedimientos existentes para PSA de plasma seminal y para AGP de suero. Para ello se han construido columnas de cromatografía de inmunoafinidad (IAC) con anticuerpos anti-PSA ó anti-AGP. En la purificación de PSA a partir de plasma seminal, se ha llevado a cabo el estudio de repetibilidad de fabricación de las columnas anti-PSA y su comportamiento a largo plazo. Para la purificación de PSA a partir de suero fue necesario disociar previamente el complejo PSA-α1 antiquimotripsina. Mediante CE, dicroísmo circular y electroforesis bidimensional en gel (en colaboración con la Universidad de Gerona), se comprobó que en las condiciones elegidas, la reacción de disociación no alteraba el comportamiento electroforético de PSA ni su estructura secundaria. Esta metodología se aplicó a un suero de enfermo con PCa con una elevada concentración de PSA (>20.000 ng/mL). Tras la disociación del complejo y la posterior inmunopurificación (IAC) se obtuvo por CE un perfil de PSA bien resuelto y libre de interferentes, con diferentes proporciones de isoformas que en el perfil de PSA patrón de plasma seminal de sanos. Para aislar PSA de orina, se desarrolló un tratamiento previo de muestra para eliminar materia en suspensión y proteínas abundantes de alto peso molecular, y concentrar un elevado volumen de muestra para su introducción en la columna de IAC. Dicho pre-tratamiento permitió obtener porcentajes de recuperación elevados de la proteína en cada uno de los pasos. Se aplicó esta metodología junto con IAC para aislar el PSA de muestras de orina de individuos sanos y con enfermedades prostáticas y se obtuvo el perfil de CE de PSA en ellas. El principal problema encontrado con esta matriz fue la presencia de interferentes, que co-migraban con el PSA en CE, alterando su perfil electroforético. De los distintos enfoques estudiados para la eliminación de estos interferentes, la purificación en una columna construida en el laboratorio con IgG1 de ratón como ligando, previa a la inmunopurificación en columna anti-tPSA, fue el único procedimiento que permitió obtener un perfil de CE de isoformas de PSA procedente de orina libre de interferentes. Para purificar AGP a partir de suero, en primer lugar, se modificó ligeramente el método de doble-purificación por IAC establecido previamente en nuestro laboratorio, con el fin de aumentar el porcentaje de recuperación de la proteína. Para purificar AGP de orina se empleó el mismo pre-tratamiento de muestra que en el caso de PSA, incluyéndose adicionalmente la adición de anti-proteasas. Con el fin de lograr un grado de pureza adecuado para el análisis de las isoformas de AGP por CE, tanto procedente de suero como de orina, fue necesario combinar la etapa de IAC con una limpieza exhaustiva de la fracción eluida de la columna empleando dispositivos de ultrafiltración. Por tanto, se han desarrollado las metodologías de purificación de PSA y AGP a partir de orina y suero, que son compatibles con el análisis por CE de isoformas de estas glicoproteínas. Dichas metodologías se aplicaron a muestras de interés clínico, es decir, a muestras procedentes de pacientes con cáncer de próstata e hiperplasia benigna de próstata. Esto permitió, por primera vez en nuestro laboratorio, la comparación de los perfiles de electroforesis capilar del PSA y de la AGP aislados de muestras de pacientes con distintas patologías prostáticas.