Factores transcripcionales de la clase DOF en la regulación génica en semillas

Resumen

Los factores transcripcionales de la clase DOF son una familia de proteínas implicada en la regulación de la expresión génica de procesos específicos de plantas que se unen a la secuencia 5'-(T/A)AAAG-3' en los promotores de los genes que regulan. La presente tesis versa sobre: 1,- La identificación y anotación de nuevos genes DOF de cebada. 2,- La caracterización molecular y funcional de dos nuevos factores DOF de esta especie implicadas en la regulación de genes específicos de semillas. 3,- La realización de un análisis filogenético evolutivo de la familia DOF en siete especies representativas de la evolución de las plantas, el alga verde Chlamydomonas reinhardtii, el musgo Physcomitrella patens, el helecho Selaginella moellendorffii, la gimnosperma Pinus taeda, la angiosperma dicotiledónea Arabidopsis thaliana y las dos angiospermas moncotiledóneas Oryza sativa y Hordeum vulgare. En C.reinhardtii hemos identificado un único miembro de la familia DOF, en P.patens nueve, y ocho en S.moellendorffti y P.taeda. En cebada, nuestra especie de interés, se han identificado y anotado 18 nuevos miembros de esta familia en las bases de datos, que se suman a los ocho previamente anotados en este laboratorio. Para profundizar en el origen y evolución de esta familia de factores transcipcionales, realizamos un análisis filogenético con los DOFs previamente identificados y aquellos de A.thaliana y O.sativa. Todos estos genes pueden agruparse en seis familias de genes ortólogos y parálogos que se habrían originado desde un grado basal parafilético o subfamilia A. La estructura de intrones y exones del gen DOF de C.reinhardtii apoya la formación del primer DOF por barajado de exones en el ancestro de las plantas. Así, duplicaciones del DOF ancestral durante el subsiguiente proceso evolutivo habría ocasionado la formación de una familia de noventa y dos miembros en las plantas vasculares aquí estudiadas. Nuestros datos, sugieren además que la pérdida, adquisición y barajado de motivos conservados además del DOF entre los nuevos genes, habría condicionado la formación de las siete subfamilias aquí descritas. Entre los ventiséis genes DOF anotados en cebada, HvDof17 y HvDof19 fueron seleccionados para su caracterización posterior, ya que se expresaban preferentemente en la aleurona de las semillas en germinación. En la aleurona post-germinativa de los granos de creales, se sintetizan un conjunto de hidrolasas, cuya expresión está inducida por GA y reprimida por ABA, que posteriormente se secretan en el endospermo amiláceo liberando los nutrientes que se movilizaran hacia el embrión. En los promotores de estos genes se ha identificado un motivo tripartito en cis necesario para una respuesta plena a GA (GARC: GA-Responsive Complex). Por el contrario, los elementos regulatorios en cis que median la respuesta de estos genes al ABA son desconocidos. Los tránscritos del gen HvDof19 se acumulan en la capa de aleurona en respuesta a ABA, estando su expresión, así como la del otro gen seleccionado, HvDof17, reprimida por GA. En este tejido, HvDOF19 media la represión por ABA del gen CatB, que codifica una tiol proteasa del tipo catepsina B, y HvDIF17 contribuye a la regulación negativa de este gen en una ruta independiente de esta hormona. Ambos factores son capaces de revertir la trans-activación del gen CatB medida por GAMYB, el cual pertenece a la clase de factores R2R3MYB y está implicado en la activación de la expresión de genes de hidrolasas en respuesta a GA; e interaccionan con él in vivo. En el endospermo en desarrollo de cebada, hemos determinado que HvDOF 17 y HVDOF19 también regulan la expresión del gen Hor2, que codifica la proteína de reserva B-hordeína. El patrón de expresión de HvDof19 durante la maduración del endospermo, se ajusta a su comportamiento como activador transcripcional del gen Hor2 y a la interacción detectada entre éste y BLZ2, un activador de la expresión de este mismo gen previamente caracterizado en el laboratorio. Por el contrario, HvDIF 19 reprime la expresión del gen Hor2. En conclusión, esta tesis contribuye a un mejor conocimiento de la regulación transcripcional de los genes de hidrolasas en respuesta a ABA, y muestra la implicación de HvDOF19 y HvDOF17 en la activación y represión, respectivamente, de los genes que codifican proteínas de reserva en la semilla de cebada.