Desarrollo de procesos enzimáticos selectivos para aplicaciones nutricionales

Resumen

La investigación sobre los efectos benéficos de los alimentos en la salud humana ha experimentado un crecimiento exponencial en la última década, debido a que los consumidores son cada vez más consientes de la relación que existe entre una dieta balanceada y un óptimo estado de salud. Lo anterior ha llevado a la producción de alimentos funcionales o nutracéuticos, entre los cuales se incluyen alimentos que han sido fortificados, enriquecidos, modificados o mejorados. Por ello, el objetivo del presente trabajo ha sido desarrollar diferentes procesos enzimáticos en los que el perfil de ácidos grasos del producto original fuera cambiado para incorporar ácidos grasos de valor nutricional y funcional. En la primera etapa de esta tesis doctoral se prepararon fosfolípidos (PL) ricos en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). Para el desarrollo de esta tarea se emplearon los fosfolípidos: fosfatidilcolina (PC), fostatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI) y ácido fosfatídico (PA); y los PUFA: CLA (ácido linoleico conjugado), DHA (ácido docosahexaenoico) y EPA (ácido eicosapentaenoico). Las variables a evaluar eran la relación molar de sustratos (1:1, 1:5, 1:8 y 1:10; PL:PUFA), temperatura (30, 40, 50 y 60°C), tiempo de reacción (4, 8, 12, 24 y 48h) y la carga de enzima (10, 20 y 30% p/p con respecto a la mezcla de sustratos). De los experimentos realizados, los mejores resultados se obtuvieron para la reacción de interesterificación de PC y CLA bajo las siguientes condiciones: relación molar 1:8 (PC:CLA), 8 h, 50oC, 300 rpm (agitación orbital) y 10% enzima, logrando incorporar el 21,5% del CLA en PC. La segunda etapa consistió en el desarrollo y optimización de la síntesis de fosfolípidos ricos en PUFA. Para realizar esta tarea se emplearon PC y CLA. Los parámetros que se evaluaron son: relación molar de sustratos (1:2, 1:4, 1:6, 1:8 y 1:10; PC:CLA), temperatura (20, 30, 40, 50 y 60oC) y la carga de enzima (2, 5, 10, 15 y 20%; en peso con respecto a la mezcla de sustratos). Paralelamente a estos estudios, se empleó la metodología de superficie de respuesta para optimizar el sistema de reacción y definir la interacción y efecto de las variables de estudio en la incorporación de CLA en PC. Las condiciones optimas encontradas son: relación molar 1:4 (PC:CLA), 24 h, 50oC, 200 rpm (agitación orbital) y 15% enzima, logrando incorporar el 90% del CLA en PC. Siguiendo la misma línea de investigación, en la tercera etapa de esta tesis doctoral se estudió la formación de lisofosfatidilcolina (LPC) a partir de PC, empleando dos sistemas de reacción (etanol y agua) y enzimas libres e inmovilizadas (15% en peso con respecto al total de PC), evaluando el efecto de la temperatura (30, 40, 50 y 60oC). De este estudio se encontró que el medio empleado, así como el tipo de biocatalizador, claramente determinan la cinética de reacción. La fosfolipasa A1 (PLA1) y la lipasa Novozym 435, ambas inmovilizadas, convirtieron PC en LPC en presencia de etanol, con rendimientos de 50% y 58,51%, respectivamente, tras 48 h de reacción a 50°C. Sin embargo, el mayor grado de hidrólisis (70%) se alcanzó con la lipasa PS tras 48 h de reacción a 60°C y 200 rpm (agitación orbital), en presencia de agua. Parte de este trabajo se realizó en la Unidad de Investigación y Desarrollo en Alimentos del Instituto Tecnológico de Veracruz (Veracruz, México). La cuarta etapa de esta tesis consistió en la preparación de diglicéridos ricos en PUFA, complementando un trabajo de master realizado en el mismo laboratorio del Instituto de Catálisis y Petroleoquímica-CSIC. Para ello se emplearon aceite de pescado y glicerol. Los parámetros evaluados son la relación molar de sustratos (1; 1,4; 2; 2,6 y 3; aceite/glicerol), temperatura (40, 44, 50, 56 y 60°C) y la carga de enzima (5, 7, 10, 13 y 15% p/p con respecto a la mezcla de sustratos) mediante la metodología de superficie de respuesta. Las condiciones de reacción que nos condujeron a la mayor obtención (50%) de DAG son: relación molar 2 (aceite:glicerol), 60oC y 15% de enzima, con una agitación orbital de 200 rpm tras 24 h. Paralelamente a estos experimentos, se evaluó también el efecto de la agitación (orbital y magnética) empleando diferentes temperaturas (65, 70, 75, 80, 85 y 90°C) y velocidades de agitación (300, 500, 700 y 900 rpm). Las condiciones óptimas para alcanzar la mayor cantidad de DAG fueron: 65°C, una relación molar aceite:glicerol de 3:1, agitación magnética a 500 rpm y 15% p/p de enzima, después de 2,5 h, con un rendimiento de 60%. La composición del diglicérido obtenido es: EPA (11,32%), DPA (8,34%) y DHA (69,71%). La quinta etapa de esta tesis consistió en el enriquecimiento de ácido ¿-linolénico (GLA) catalizado por la lipasa de Candida rugosa en un sistema libre de solvente. Se empleó un aceite (evening primrose oil) que contenía 8.8% p/p de GLA. Los experimentos incluyeron la evaluación de diferentes cargas de enzima (5, 10, 15 y 20%, p/p con respecto a la mezcla de sustratos), temperatura (10, 20, 30, 40, 50 y 60oC) y relaciones molares (1:4, 1:6, 1:8, 1:10 y 1:12, EPO-FA:BtOH). De los resultados obtenidos se obtuvo un incremento en el contenido de GLA hasta del 70% a 30°C, agitación magnética a 400 rpm, 10% p/p de enzima y una relación molar 1:10 tras 24 h de reacción. Posteriormente, empleando tamiz molecular (10% p/p con respecto a la mezcla de sustratos) y bajo las condiciones óptimas se pudo incrementar el contenido de GLA a 83,74% tras 36 h de reacción. Esta etapa se realizó en el Departamento de Alimentos y Nutrición del Colegio de Ciencias de la Salud, en la Universidad de Corea (Seúl, Corea del Sur). Finalmente podemos decir que los diferentes procesos enzimáticos que se desarrollaron a lo largo de esta tesis nos condujeron satisfactoriamente a la preparación de productos ricos en ácidos grasos de valor nutricional y funcional y por otro lado aprovechar la especificidad de las enzimas en los distintos sistemas de reacción que empleamos. Las condiciones de reacción encontradas tienen ventajas sobre otros procesos reportados en la literatura entre las que podemos mencionar temperaturas más bajas, sistemas libres de solventes y un mayor contenido de los diferentes PUFA estudiados.